王亞婷，李文生，閆小飛，齊宗利，郭 華

(1.陜西省人民醫(yī)院病理科，西安 710068；2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710061)

子宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤，嚴重威脅著女性的生命健康。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染，是宮頸癌的重要啟動因子[1]。在世界范圍內(nèi)，高危型HPV感染常見型別是HPV16和HPV18型，但在我國宮頸病變中，HPV58型是繼HPV16之后的重要型別[2]。研制HPV58型預(yù)防及治療性疫苗，對降低我國宮頸癌發(fā)生率尤為重要。

HPV基因組結(jié)構(gòu)按功能可分為上游調(diào)節(jié)區(qū)(LCR)、早期基因區(qū)(E1，E2，E4，E5，E6，E7)和晚期基因區(qū)(L1，L2)。其中，E6，E7基因編碼的蛋白與宿主細胞轉(zhuǎn)化功能直接相關(guān)，L1基因編碼的衣殼蛋白可自我組裝成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)，可刺激機體產(chǎn)生長效的中和抗體[3]。目前已經(jīng)上市的兩種HPV疫苗均是以L1蛋白為目標抗原的重組疫苗[4]，均為預(yù)防性疫苗，對于已經(jīng)感染HPV及發(fā)生宮頸癌的病人沒有治療作用，同時已上市的兩種L1 VLP混合型HPV預(yù)防性疫苗都是針對歐美地區(qū)HPV在宮頸癌中的流行分布特點研發(fā)，均不含HPV58 L1 VLP。

結(jié)合我國宮頸癌發(fā)生的實際情況，研制高效廉價的預(yù)防性和治療性HPV58型疫苗是我國宮頸癌防治的最佳策略之一。本研究利用昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)構(gòu)建了由HPV58 L1蛋白組成的病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)，在VLP內(nèi)部包裹突變型HPV58 E7基因(通過突變?nèi)コ薊7蛋白的轉(zhuǎn)化活性，但保持了它的抗原性)，制備了HPV58VLP/E7DNA“假病毒”疫苗，同時具有預(yù)防和治療作用，用“假病毒”疫苗免疫小鼠，評估疫苗的體液和細胞免疫效果。

1材料與方法

1.1 實驗材料 含HPV58 L1的重組昆蟲-桿狀病毒以及Tc-1細胞由本實驗室保存；mE7-pcDNA3.1+質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建；HPV58 E7蛋白由本實驗室純化保存；sf9昆蟲細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。小鼠抗HPV58L1單克隆抗體MAB885購自美國Millipore公司；HRP標記山羊抗鼠IgG抗體購自Santa Cruz公司；Grace’s昆蟲細胞培養(yǎng)液購自invitrogen公司。小鼠IFN-γ ELISA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。C57BL/c小鼠，Balb/c雌性，8～10周齡，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 HPV 58 L1重組蛋白的表達鑒定及假病毒的組裝：利用重組的桿狀病毒感染sf9昆蟲細胞，4天后收集細胞，0.5 mg/dl NP-40裂解細胞，1 000 r/min離心10 min收集細胞核，超聲裂解細胞核，12 000 r/min離心收集上清，加入His-Ni親和層析純化HPV58 L1 VLP，100 μg的HPV58 VLPs 用解離緩沖液(pH 7.15 Tris-HCl，0.115 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L DTT)室溫透析2 h，然后向已經(jīng)解離的衣殼粒中加入100 μg的mE7-pcDNA3.1+質(zhì)粒，采用5 mmol/L的CaCl2室溫透析過夜，超速離心后，收集組分行HPV58 E7基因PCR擴增。

1.2.2 電鏡觀察：將需要觀察的樣品進行透析除去其中的高濃度鹽分，吸取10 μl樣品滴于銅網(wǎng)支持的碳膜上，經(jīng)磷鎢酸復(fù)染，H- 600透射電鏡觀察。

1.2.3 小鼠紅細胞凝集試驗：取正常C57BL/c小鼠紅細胞，制成10 ml/L懸液；取不同稀釋度的裂解細菌上清，50 μl分別加至96孔圓底板，再加50 μl紅細胞懸液，4℃孵育3 h觀察。

1.2.4 動物免疫：將“假病毒” 以及VLPs免疫Balb/c小鼠。每只小鼠滴鼻免疫50 μg“假病毒”或VLPs，14天后進行加強免疫，接種與第1 次相同劑量的抗原。免疫后7天進行免疫效果評價。作為陰性對照的小鼠以PBS滴鼻處理。

1.2.5 ELISA法檢測血清中IgG和IgA含量：用HPV16 VLPs包被酶標板，4℃包被過夜。用洗滌液洗3次，加入封閉液室溫封閉4 h；用洗滌液洗3次，分別加入不同稀釋度的小鼠血清，室溫反應(yīng)2 h；用洗滌液洗3次，加入HRP-標記的二抗，室溫反應(yīng)2 h。用洗滌液洗3次，加入底物后顯色，利用酶標儀測定450 nm光吸收。

1.2.6 脾淋巴細胞IFN-γ的分泌水平測定：將5×106/ml的效應(yīng)細胞接種于細胞板中，E7蛋白5 μg/ml進行體外刺激，于37℃ 5%(v/v) CO2培養(yǎng)箱孵育72 h后，取其上清液ELISA檢測IFN-γ濃度。在酶標板中設(shè)好倍比稀釋的標準品作為對照，每孔分別加入樣品100 μl，各設(shè)3個復(fù)孔。按試劑盒說明步驟依次加入檢測工作液、洗滌液、顯色劑各100 μl，其間洗板5次，最后加入終止液，測吸光度A450nm，繪制標準曲線并推算各樣本的濃度。

1.2.7 CTL反應(yīng)的測定：利用LDH方法測定小鼠脾淋巴細胞的CTL反應(yīng)。將小鼠脾淋巴細胞作為效應(yīng)細胞，Tc-1細胞(利用HPV16的E6和E7基因轉(zhuǎn)化的C57BL 6小鼠的細胞系)作為靶細胞進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用單因素方差(Turkey)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2實驗結(jié)果

2.1HPV58L1蛋白在sf9昆蟲體系中大量表達 收集接種了重組昆蟲-桿狀病毒的sf9細胞，SDS-PAGE和Western-blotting分析結(jié)果顯示，感染HPV58L1重組病毒的sf9細胞表達了約56kD的目的蛋白，其分子量大小與HPV58L1理論預(yù)期值一致，而sf9細胞組未見特異性條帶，見圖1A，1B)，表明HPV58L1蛋白確實在sf9細胞中得到高效表達。小鼠紅細胞凝集實驗結(jié)果顯示，sf9細胞表達的HPV58L1蛋白可引起小鼠紅細胞凝集，說明表達的HPV58L1蛋白具有較好的生物活性，見圖1C。

(A)SDS-PAGE 鑒定sf9細胞表達HPV58 L1蛋白。lane 1.低分子量蛋白標準品；lane 2.感染了HPV58 L1重組桿狀病毒的sf9細胞核裂解上清；lane 3.使用空白桿狀病毒感染sf9細胞核裂解上清。(B)Western-blotting鑒定sf9細胞表達的HPV58 L1蛋白。lane 1.空白桿狀病毒感染sf9昆蟲細胞裂解物；lane 2.重組桿狀病毒感染sf9昆蟲細胞裂解物。(C)小鼠紅細胞凝集試驗分析純化后HPV58 L1蛋白的生物活性。

2.2HPV58L1蛋白的電鏡形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)電鏡觀察證實，純化的HPV58L1蛋白可形成直徑約55nm的球形空心顆粒(圖2A)，與HPVVLP相符，說明表達的L1蛋白有形成VLP的能力，使用解離緩沖液處理病毒樣顆粒，室溫透析2h，電鏡觀察可以看到呈解離狀態(tài)的病毒樣顆粒亞基(圖2B)。解離的病毒樣顆粒亞基在CaCl2透析后，能重新聚合成“假病毒”(圖2C)。取少量重新聚合的“假病毒”進行PCR擴增，擴增出特異性條帶，大小約340bp，與HPV58E7基因大小相符，證實重新聚合的病毒樣顆粒中包裹有mE7-pcDNA3.1+質(zhì)粒。

(A)電鏡觀察HPV58 L1蛋白形成的VLP；(B)VLP經(jīng)解離緩沖液處理后的電鏡形態(tài)；(C)CaCl2和mE7-pcDNA3.1+質(zhì)粒存在下重新聚合的“假病毒”；(D)PCR擴增“假病毒”中的HPV58 E7基因。

2.3VLP和“假病毒”刺激機體產(chǎn)生體液和黏膜免疫反應(yīng) 用VLP和“假病毒”滴鼻免疫Balb/c小鼠，再次加強免疫7天后，血清學(xué)ELISA結(jié)果顯示：VLP和“假病毒”均能引起顯著的體液和黏膜免疫反應(yīng)，但是兩者之間無顯著性差異，而PBS組未檢出抗HPV58IgG，IgA，見圖3A和3B。

圖3 小鼠血清中HPV58 L1特異性IgG

2.4 “假病毒”引起細胞免疫反應(yīng)IFN-γ是Th1細胞分泌的重要細胞因子，用HPV58E7蛋白體外刺激免疫小鼠脾細胞，通過ELISA定量檢測IFN-γ分泌情況，“假病毒”免疫組產(chǎn)生的IFN-γ明顯高于VLP免疫組與空白組(P<0.001)(圖4A)。CTL反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“假病毒”免疫過的小鼠脾淋巴細胞可以特異性殺傷Tc-1 細胞，引起CTL反應(yīng)，而VLPs免疫的小鼠則無此反應(yīng)(圖4B)。

(A)用E7蛋白體外刺激免疫后小鼠脾細胞，通過ELISA定量檢測IFN-γ分泌情況。“假病毒”免疫組產(chǎn)生的IFN-γ明顯高于VLP免疫組與空白組(P<0.001)。(B)“假病毒”免疫引起E7特異性的CTL反應(yīng)(P<0.001)。

3討論人乳頭瘤病毒L1衣殼蛋白在病毒感染過程中有著非常重要的作用，通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生針對病毒外殼的中和抗體，可以減少病毒的入侵，達到保護效果[5]。目前上市的HPV疫苗，就是針對L1蛋白的預(yù)防性疫苗，流行病學(xué)研究證實，此類疫苗可有效預(yù)防HPV感染，但對于已有HPV感染或癌前病變者并無明顯治療作用。

HPV持續(xù)感染時，病毒早期基因整合到細胞基因組中，E6，E7蛋白結(jié)合并促進腫瘤抑制蛋白p53及pRb的降解，干擾細胞周期，促進細胞惡變[6，7]。但機體缺乏HPV特異的T細胞免疫反應(yīng)性，不能及時有效地清除表達E6，E7蛋白的HPV感染細胞，刺激機體產(chǎn)生HPV特異性T細胞免疫反應(yīng)，開發(fā)針對HPV感染相關(guān)癌前病變的治療性疫苗，是HPV疫苗研發(fā)的另一熱點。

本研究中利用sf9昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)表達HPV58 L1蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析證實，在大約56kD處出現(xiàn)了可與HPV58 L1 mAb特異性結(jié)合的條帶，表明sf9昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)可成功表達L1目的蛋白。小鼠紅細胞凝集試驗證實表達的HPV58L1 有誘導(dǎo)小鼠紅細胞凝集的能力，表明蛋白具有較好的活性。電鏡觀察可見表達蛋白有自組裝成VLP的能力。用解離緩沖液室溫透析純化的VLP顆粒，聚集的VLP衣殼蛋白發(fā)生解離，向已經(jīng)解離的衣殼粒中加入mE7-pcDNA3.1+質(zhì)粒，再用CaCl2室溫透析過夜，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，VLP可以解聚和再聚集，再聚合的“假病毒”顆粒中包裹有E7DNA，這個“假病毒”具有病毒的外殼蛋白，而里面包裹的是經(jīng)過改造沒有轉(zhuǎn)化危險的E7基因，因此，從理論上講，這個假病毒具有嵌合疫苗的作用，即可以預(yù)防HPV58病毒的感染，同時還可以治療HPV58導(dǎo)致的宮頸癌前病變或?qū)m頸癌。

分別用HPV58 VLP和 “假病毒”免疫小鼠，動物實驗結(jié)果證實，HPV58VLP和假病毒都能夠引起宿主體液免疫反應(yīng)，血清中產(chǎn)生足夠數(shù)量的IgG中和抗體。由于HPV主要感染上皮細胞，因此分泌型抗體IgA是抵抗HPV病毒感染的首要防線。經(jīng)黏膜免疫，VLP和假病毒均能產(chǎn)生分泌型IgA抗體，這些結(jié)果表明：“假病毒”具有預(yù)防HPV感染的效果。IFN-γ是細胞免疫反應(yīng)的重要特點，“假病毒”刺激機體產(chǎn)生的IFN-γ明顯高于VLP免疫組，而且“假病毒”免疫過的小鼠脾淋巴細胞可以特異性的殺傷Tc-1細胞，引起CTL反應(yīng)，說明“假病毒”除了可以預(yù)防HPV感染之外，還能夠刺激機體產(chǎn)生HPV特異性T細胞免疫反應(yīng)，特異性殺傷HPV感染的陽性細胞，具有HPV治療性疫苗的作用。

本實驗研制的新型HPV58VLPL1/E7DNA“假病毒”疫苗，可引起宿主的抗體反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)，為防治HPV58感染及其所致的宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)病變提供新的思路。

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