李 昂，吳維青，呂 辛，崔英霞，夏欣一，劉志紅，李曉軍

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.解放軍南京總醫(yī)院a.檢驗醫(yī)學(xué)研究所；b.腎臟病研究所，南京 210002)

Ⅳ型膠原基因COL4A3，COL4A4和COL4A5突變可導(dǎo)致Alport綜合征(Alport syndrome，AS)，三個基因分別包含52，47，51個外顯子，且沒有突變熱點，應(yīng)用傳統(tǒng)Sanger測序進行基因診斷費時費力且價格高昂[1]。COL4A3，COL4A4基因突變臨床表型具有高度異質(zhì)性，可導(dǎo)致常染色體顯性AS，常染色體隱性AS，良性家族血尿(benign familial hematuria，BFH)等[2]。臨床上對AS和BFH的診療方案及預(yù)后判斷不同，疾病早期癥狀不典型，故很難進行鑒別診斷[3]，因此，應(yīng)用恰當(dāng)方法對疑似AS患者及家系進行早期病因?qū)W診斷及鑒別診斷尤為重要。二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)由于其高通量、低成本等優(yōu)勢逐漸應(yīng)用于科研及臨床診斷[4]。本研究擬探討靶基因捕獲聯(lián)合二代測序技術(shù)在AS病因診斷及家系不同臨床表型成員遺傳學(xué)實驗診斷中的應(yīng)用價值。

1材料與方法

1.1 研究對象 2012年1月～2014年12月期間，在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院就診的2個遺傳性腎病家系，先證者依據(jù)經(jīng)典gregory標(biāo)準[5]確診為Alport綜合征，2家系先證者的父母均為近親婚配，見圖1。

1.2 試劑和儀器 QIAamp DNA Blood MiNi Kit(Qiagen，Hilden，Germany)基因組DNA提取試劑；課題組自行設(shè)計的遺傳性腎病捕獲芯片(NimbleGen，Roche)；Illumina Hiseq2500測序平臺(美國)；ABI 3730xl DNA測序儀。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA的提?。航?jīng)患者簽署知情同意書后，抽取先證者及家系成員外周血4 ml，EDTA抗凝，按照全血DNA提取試劑盒標(biāo)準步驟進行。

1.3.2 靶序列捕獲芯片的設(shè)計：根據(jù)NCBI和OMIM數(shù)據(jù)庫，確定常見遺傳性腎病(包括 PKD，AS，BFH，SRNS等)的相關(guān)78個致病基因，根據(jù)這些基因序列設(shè)計特異雜交捕獲探針，捕獲區(qū)域包含這些基因外顯子及側(cè)翼序列，制定特異性遺傳腎病相關(guān)基因捕獲芯片(NimbleGen，Roche)。

1.3.3 目標(biāo)區(qū)域高通量二代測序：根據(jù)標(biāo)準流程進行目標(biāo)序列的捕獲和富集、測序文庫的建立和高通量測序，大體步驟如下：使用超聲波儀將基因組DNA打斷變成200～300 bp的碎片(Covaris S2，Massachusetts，USA)。末端連接Illumina的寡核苷酸接頭(單端)，在連接完成后使用一種高保真聚合酶以及包含定制barcode序列的PCR引物4個循環(huán)的擴增來驗證接頭連接是否成功。通過PCR來完成文庫構(gòu)建并用于進一步分析，來自10個文庫的DNA接頭連接片段和索引片段被混在一起并與定制的寡核苷酸探針進行雜交。完成雜交和清洗后，使用300 ml洗脫緩沖液(qiagen，valencia，CA，USA) 洗脫探針溶液中與寡核苷酸探針結(jié)合在一起的DNA片段。測序引物完成雜交之后，在中國天津華大基因股份有限公司的Illumina Hiseq2500平臺上(illumine，San Dieago，CA，USA)進行雙端測序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析：測序獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina Pipeline version (1.3.4版)軟件進行處理，經(jīng)過濾去污染后使用BWA軟件包(Burrows Wheeler Aligner)比對干凈讀數(shù)[6]。由GATK IndelGenotyper確定插入和缺失變異，SOAP snp軟件確定SNP[7]。分析數(shù)據(jù)流程中使用的對照人群數(shù)據(jù)庫包括千人基因組數(shù)據(jù)庫，dbSNP數(shù)據(jù)庫和華大內(nèi)部數(shù)據(jù)庫。采用PolyPhen-2[8]和SIFT algorithm[9]算法來預(yù)測錯義突變對基因功能的影響，用Phylop (phyloP46wayPlacental)軟件來計算變異位點的保守度。

1.3.5 Sanger驗證：根據(jù)基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5軟件設(shè)計上述NGS測序發(fā)現(xiàn)的突變位點特異性引物，PCR擴增先證者及家系所有成員相應(yīng)位點，應(yīng)用Sanger測序法進行測序驗證。

1.3.6 基因型和表型分析：綜合分析2個家系所有成員的臨床表型、實驗室檢查結(jié)果、病理診斷結(jié)果及基因突變結(jié)果。

2結(jié)果

2.1 NGS測序結(jié)果 家系F1先證者(Ⅱ1)檢測到COL4A3基因純合突變c.3769G>A(p.G1257R)，家系F2先證者檢測到COL4A4 基因c.1715G>C(p.G572A)純合突變。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果 COL4A3 c.3769G>A和COL4A4 c.1715G>C均為甘氨酸置換突變，分別置換為精氨酸和丙氨酸。在千人基因組數(shù)據(jù)庫，dbSNP數(shù)據(jù)庫和華大內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中均無頻率記錄，Phylop(phyloP46wayPlacental)軟件預(yù)測突變高度保守，PolyPhen-2和SIFT algorithm均預(yù)測突變有害。根據(jù)ACMG標(biāo)準[10]，這兩個錯義突變均屬于可能致病性突變。

2.3 Sanger測序驗證結(jié)果 F1家系先證者(F1-Ⅱ1)攜帶COL4A3基因純合突變 c.3769G>A(p.G1257R)，先證者父母及胞妹均為此突變的雜合子，見圖2；F2家系先證者(F2-Ⅱ1)攜帶COL4A4基因純合突變c.1715G>C(p.G572A)，先證者父母及胞妹均為此突變的雜合子，見圖3。

2.4 基因型和表型分析結(jié)果

2.4.1 家系F1：具有COL4A3基因純合突變 c.3769G>A(p.G1257R)的先證者(F1-Ⅱ1)，其臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、肌酐輕度增高伴高頻感音性耳聾；電鏡下基底膜厚薄不一、致密層撕裂分層；Ⅳ型膠原免疫熒光檢測結(jié)果顯示基底膜α3鏈節(jié)段缺失，α5鏈完全缺失；臨床診斷為AS。攜帶雜合COL4A3 c.3769G>A突變的先證者父母(F1-Ⅰ1，F(xiàn)1-Ⅰ2)、胞妹(F1-Ⅱ2)的臨床表現(xiàn)均為孤立性血尿，見表1。

家系F2：具有COL4A4 c.1715G>C(p.G572A)純合錯義突變的先證者(F2-Ⅱ1)，其臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、正常腎功能伴高頻感音性耳聾；電鏡下基底膜厚薄不一、致密層撕裂分層，呈“花籃樣”改變；IV型膠原免疫熒光檢測結(jié)果顯示基底膜α3鏈和α5鏈均節(jié)段缺失；臨床診斷為AS。攜帶COL4A4 c.1715G>C(p.G572A)雜合突變的先證者母親(F2-Ⅰ2)及胞妹(F2-Ⅱ2)臨床表現(xiàn)為孤立性血尿，而同樣為此突變的雜合子的先證者父親(F2-Ⅰ1)未見異常表現(xiàn)，見表1。

Hom，homozygote代表純合子；Het，Heterozygote代表雜合子。

Hom，homozygote代表純合子；Het，Heterozygote代表雜合子。

表1 兩個AS家系成員臨床資料和基因突變結(jié)果

3討論Alport綜合征(AS)是遺傳性腎病最常見的類型之一，致病基因為Ⅳ型膠原編碼基因COL4A3，COL4A4及COL4A5。COL4A3和COL4A4基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性或隱性Alport綜合征，而COL4A5基因突變導(dǎo)致X連鎖隱性AS[11]。這三個基因分別包含52，47，51個外顯子，且沒有突變熱點，因而應(yīng)用傳統(tǒng)的PCR結(jié)合Sanger測序法進行致病基因突變成本昂貴且耗時耗力。本課題組，自行設(shè)計了遺傳性腎病致病基因捕獲芯片，結(jié)合二代測序技術(shù)，可對導(dǎo)致Alport綜合征、多囊腎等多種遺傳性腎病78個基因同時進行突變檢測。我們的研究數(shù)據(jù)表明，本檢測方法能夠在較短時間內(nèi)明確絕大多數(shù)AS患者致病原因，也可對表型較為輕微的疑似患者進行鑒別診斷。鑒于靶基因捕獲二代測序技術(shù)所具有的高通量、低成本及在致病基因突變檢測的有效性，在Alport綜合征病因診斷、鑒別診斷等方面已經(jīng)開始取代傳統(tǒng)的Sanger測序，發(fā)揮了越來越重要的作用。

COL4A3和COL4A4基因編碼Ⅳ型膠原蛋白α3，α4鏈，這兩個基因雜合突變可引起常染色顯性Alport綜合征[3]，薄基底膜病(thin basement membrane nephropathy，TBMB)或稱為家族良性血尿(benign familial hematuria，BFH)[2]，也有研究表明亦和局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)相關(guān)[12]。也就是說COL4A3或COL4A4基因的雜合突變表型具有非常高的異質(zhì)性，攜帶者臨床表現(xiàn)譜非常廣泛，包含了完全正常、BFH及Alport綜合征；即便是在攜帶同一突變的同一家系內(nèi)部，不同成員的臨床表現(xiàn)也具有明顯差異。本研究家系F2中，同樣為COL4A4 c.1715G>C突變攜帶者，F(xiàn)2-I 2和F2-Ⅱ1表現(xiàn)為BFH，而F2-I 1則完全正常，也證明了Ⅳ型膠原基因變異臨床表型的異質(zhì)性，這可能和疾病不全外顯有關(guān)。

BFH和常染色體隱性Alport綜合征可同時影響一個家系，但二者的臨床表現(xiàn)及預(yù)后明顯不同，Alport綜合征臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、進行性腎損傷伴或不伴高頻感音性耳聾及視力異常，而BFH以孤立性血尿為臨床特征，腎功能往往正常。早期使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)可有效緩解Alport綜合征進展為終末期腎病，而BFH可僅觀察及預(yù)防，所以兩種疾病的早期診斷和鑒別診斷尤為重要[13～15]。以往BFH和Alport綜合征的診斷依賴臨床癥狀和病理，但在早期臨床癥狀和病理結(jié)果不典型情況下，做出明確診斷非常困難[16]，而且不是所有患者或家屬能夠接受活檢這樣的有創(chuàng)檢測。而外周血標(biāo)本進行基因診斷卻具有獨特的優(yōu)勢，相比于病理診斷，其對病人造成的創(chuàng)傷小且更加精準高效，結(jié)果不隨病人疾病進展發(fā)生變化。本研究中，攜帶基因突變的夫妻生育的每個孩子都有四分之一的概率為Alport綜合征患者，而兩家系先證者胞妹均具有血尿表現(xiàn)，因而不能排除Alport綜合征的可能。經(jīng)過基因診斷，均被證明為基因突變攜帶者。我們建議，針對有血尿傾向的疑似Alport綜合征的家系，尤其是有血尿家族史而無詳細臨床和病理資料時，家系所有成員都需進行基因診斷、明確基因型，這不僅有助于已有臨床表現(xiàn)患者的鑒別診斷，還可以預(yù)測其他家系成員將來可能的臨床表現(xiàn)，從而指導(dǎo)家系的遺傳咨詢和精準診療。

總之，我們的研究表明靶基因捕獲聯(lián)合高通量測序技術(shù)在Alport綜合征病因診斷中發(fā)揮重要的作用；結(jié)合Sanger測序法，可對Alport綜合征家系不同表型患者做出精準診斷；建議具有家族性血尿的家系所有患者都進行基于二代測序的基因突變檢測，為家系的精準診療和遺傳咨詢創(chuàng)造條件。

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