王小川 黃旭晴 高忠明 陶陳娟 姜海波

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種氣流受限為特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。近年來，COPD肺外系統(tǒng)病變也得到了廣泛的重視[1]。研究發(fā)現(xiàn)，全身不良反應(yīng)是COPD高發(fā)病率和高死亡率的主要原因。腦組織對缺氧極其敏感。COPD由于不可逆的氣流受限，造成腦部長期慢性缺氧，最終會導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷。另外，COPD患者全身系統(tǒng)性炎癥也會加劇腦神經(jīng)損傷[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者長期缺氧導(dǎo)致了腦灰質(zhì)細(xì)胞的丟失和體積減小[3-4]。本研究通過建立動物模型觀察COPD腦損傷對外周血中炎癥因子和神經(jīng)相關(guān)分子水平變化，為臨床COPD中樞病變的早期診斷、病情惡化和預(yù)后及治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 2月齡雄性SD大鼠（200～250g）購于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成COPD組和對照組各20只。大鼠飼養(yǎng)室溫控制在（23±1）℃，自由飲水和進(jìn)食。COPD組大鼠建模：COPD組大鼠放置在熏煙箱（80cm×60cm×50cm）里連續(xù)煙熏4個月（3次/d，10支香煙/次，每次0.5h）。對照組除正常飼養(yǎng)外不作處理。

1.2 方法

1.2.1 肺功能檢測 采用小動物肺功能儀（FinePointeTMNAM，Bucxo公司，美國）測試大鼠肺功能。3.5%的戊巴比妥鈉腹腔注射（0.1ml/100g）麻醉，氣管插管連接Bucxo數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)。平靜呼吸后，在呼氣末以注射器經(jīng)三通管迅速以相當(dāng)于潮氣量5倍的氣量充氣，然后立即脫開，連接負(fù)壓（-25cm H2O）抽氣造成深呼氣。充氣和抽氣所引起的容積變化經(jīng)計算機(jī)處理后計算出肺功能各項指標(biāo)。

1.2.2 肺組織病理檢查 肺功能測試后，兩組大鼠立即斷頭處死。取左、右肺中葉依次經(jīng)過多聚甲醛固定、脫水和石蠟包埋處理，組織5μm厚切片后脫蠟進(jìn)行HE染色。

1.2.3 大鼠各指標(biāo)檢測 肺功能測試后大鼠斷頭取血，7 000r/min 4℃低溫離心10min，取上清液-80℃保存。γ 干擾素（IFN-γ）、IL-1β、IL-6、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、TNF-α、中神經(jīng)絲蛋白（NF）、神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）、Tau蛋白、腦鈉素（BNP）、大鼠髓磷脂相關(guān)糖蛋白（MAG）、髓鞘堿性蛋白（MBP）和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白（OMgp）試劑盒由美國ADL公司。采用多功能免疫熒光分析系統(tǒng)（芬蘭WALLAC公司VICTOR 21420型）；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法嚴(yán)格按照說明書操作測定各指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺功能指標(biāo)比較 與對照組比較，COPD組第50秒呼出容積占用力肺活量之比（FEV50/FVC%）為（33.0±2.8）%，明顯低于對照組的（39.1±6.4）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.441，P＜0.01）；COPD 組大鼠功能性殘氣量（FRC）為（6.0±0.7）ml，高于對照組的（3.7±1.1）ml，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.975，P＜0.01）。

2.2 兩組大鼠肺組織病理改變見圖1。

圖1 兩組大鼠肺組織病理改變（a：對照組；b：COPD組）

由圖1可見，COPD組氣道壁明顯炎癥細(xì)胞浸潤及杯狀細(xì)胞增生，氣道平滑肌和纖維組織明顯增多，氣道黏膜脫落，管腔狹窄，嚴(yán)重肺氣腫形成。

2.3 COPD組大鼠外周血炎癥因子水平變化見表1。

表1 COPD組大鼠和對照組大鼠外周血炎癥因子水平變化

由表1可見，COPD組血漿IFN-γ、IL-1β、IL-6、CRP和TNF-α均高于對照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 兩組大鼠外周血神經(jīng)相關(guān)分子水平變化見圖2。由圖2可見，COPD組血漿NF、NSE、Tau蛋白、BNP、MAG、MBP及OMgp水平均高于對照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （t=6.380、8.079、8.079、8.079、6.000、6.692、6.448、2.041，均 P＜0.05）。

2.5 COPD組大鼠外周血炎癥因子與神經(jīng)相關(guān)分子的相關(guān)性見圖3。

由圖3可見，COPD組大鼠MAG與IL-1β、BNP與IL-6、BNP 與 CRP 均呈顯著正相關(guān)（r=0.595、0.386、0.429，均P＜0.05）；對照組大鼠MAG與IL-1β、BNP與CRP呈顯著正相關(guān)（r=0.436、0.618，均 P＜0.05）。

3 討論

國內(nèi)外的資料分析均揭示吸煙是COPD形成的最主要危險因素[5-6]。在我國，吸煙者COPD患病率（15.7%）遠(yuǎn)高于不吸煙者（5.4%）[5]。本研究中，利用被動吸煙，我們成功地誘導(dǎo)了大鼠肺組織COPD病理改變及氣腫樣肺功能表現(xiàn)。吸入香煙中所含的尼古丁、亞硝胺、焦油和一氧化碳等有害物質(zhì)均可引起呼吸道炎癥反應(yīng)，呼吸道內(nèi)黏液分泌增加，進(jìn)而阻塞氣流通暢[7]。

圖2 兩組大鼠外周血神經(jīng)相關(guān)分子水平變化（a：NF；b：NSE；c：Tau 蛋白；d：BNP；e：MAG；f：MBP；g：OMgp）

圖3 兩組大鼠外周血中炎癥因子（IL-1β、IL-6和hs-CRP）與腦細(xì)胞釋放分子（MAG和BNP）的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

我們的研究揭示吸煙可以引起機(jī)體全身性炎癥反應(yīng)。這種炎癥反應(yīng)也可能反過來加重COPD的癥狀[8-9]。與我們在COPD組大鼠中發(fā)現(xiàn)相似，劉正會和李麗的研究表明，COPD患者外周血中CRP、IL-6和TNF-α的水平顯著高于健康對照組。范春紅等發(fā)現(xiàn)，COPD患者血清CRP、IL-1β和IL-17濃度水平較健康對照組均顯著升高。Sebastian等[10]觀察到在COPD穩(wěn)定期患者血漿中CRP、IL-6、IL-8和TNF-α水平都顯著升高，且IL-6和TNF-α的水平與疾病嚴(yán)重程度成正比。最近的研究[11]表明炎癥因子IL-17和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-beta，TGF-β）在 COPD 也顯著升高。

與我們在COPD的發(fā)現(xiàn)類似，磁共振研究發(fā)現(xiàn)，急性高原暴露1個月人群和缺氧性發(fā)作性全面性遺忘癥患者也存在低氧導(dǎo)致的腦損傷[12-13]。模擬海拔6 000M高原的低氧暴露大鼠腦內(nèi)海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重凋亡[13]。低氧情況下，神經(jīng)細(xì)胞可通過改變其能量代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號通路分子如蛋白激酶B（Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、一氧化氮及一氧化碳，調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及促紅細(xì)胞生成素（EPO）和它的受體來應(yīng)對低氧的影響[14]。低氧腦損傷的機(jī)制包括誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或自噬、釋放氧自由基（ROS）產(chǎn)生氧化應(yīng)激、活化PARP caspase非依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)及免疫反應(yīng)[15]。

研究表明，炎癥反應(yīng)過程是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如精神疾病、癲癇、癡呆和神經(jīng)退行性疾病的病因，并與疾病的臨床發(fā)展相關(guān)[16]。慢性炎癥能夠破壞血腦屏障的緊密連接，因此使得外周血的促炎癥因子進(jìn)入腦內(nèi)并激活小膠質(zhì)細(xì)胞[17]。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致神經(jīng)絲蛋白和髓鞘堿性蛋白丟失，進(jìn)而發(fā)生腦室周圍腦白質(zhì)軟化。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞能表達(dá)上皮模式識別受體如Toll樣受體（TLR）1-9，神經(jīng)元細(xì)胞可表達(dá) TLR2、3、4、8。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)損傷依賴于TLR2和TLR4的完整表達(dá)。靜態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞受到TLR激動劑激活，啟動細(xì)胞因子和趨化因子的迅速上調(diào)。一些細(xì)胞因子也可以透過血腦屏障主動轉(zhuǎn)運(yùn)，或者由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生繼而釋放入鄰近腦組織中[18]。

香煙中大量的細(xì)胞毒素，如一氧化碳、乙醛、亞硝胺和苯二酚等，可能直接導(dǎo)致了腦組織中神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的損害[19]。研究表明，吸煙可誘導(dǎo)Fas蛋白介導(dǎo)的大鼠腦組織細(xì)胞凋亡[20]。在阿爾茨海默病大鼠，吸煙后大鼠海馬神經(jīng)元損傷明顯加重，膠質(zhì)細(xì)胞變性明顯[21]。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)都證明暴露在煙霧中的缺血小鼠腦血流灌注能力以及毛細(xì)血管的密度均顯著下降，在煙霧中暴露的缺血小鼠的HIF-1α和VEGF的表達(dá)量顯著減少[22]。

總之，我們的研究揭示COPD可以導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞同時受損。腦組織的損傷可能是COPD慢性缺氧、外周和腦內(nèi)炎癥因子及煙霧所含細(xì)胞毒素的共同作用結(jié)果。我們的研究結(jié)果為臨床外周血檢測COPD腦損傷及對其針對性治療提供了理論依據(jù)。

[1]Kaptein AA,Scharloo M,Fischer MJ,et al.50 years of psychological research on patients with COPD--road to ruin or highway to heaven?[J].Respir Med 2009,103(1):3-11.doi:10.1016/j.rmed.2008.08.019.

[2]Chesnokova V,Pechnick RN,Wawrowsky K.Chronic peripheral inflammation,hippocampal neurogenesis,and behavior[J].Brain Behav Immun2016,58:1-8.doi:org/10.10167/j.bbi.2016.01017.

[3]Zhang H,Wang X,Lin J,et al.Reduced Regional Gray Matter Volume in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease:A Voxel-Based Morphometry Study [J].AJNR Am J Neuroradiol,2013,34(2):334-339.doi:10.3174/ajnr.A3235.

[4]Zhang H,Wang X,Lin J,et al.Grey and white matter abnormalities in chronic obstructive pulmonary disease:a case-control study[J].BMJ Open,2012,2(2):e000844.doi:10.1136/bmjopen-2012-000844.

[5]唐文芳,劉日輝,于雅琴,等.2000-2014年中國40歲以上成人慢性阻塞性肺疾病患病率的Meta分析 [J].吉林大學(xué)學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版),2015,5(41):961-968.doi:10.13481/j.1671-587x.20150515.

[6]Capistrano SJ,van Reyk D,Chen H,et al.Evidence of Biomass Smoke Exposure as a Causative Factor for the Development of COPD[J].Toxics,2017,5(4).E36.doi:10.3390/toxics5040036.

[7]李曉茹,趙子軍.吸煙與慢性阻塞性肺疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展 [J].中國慢性病預(yù)防與控制,2014,22(1):110-112.doi:10.16386/j.cjpccd.issn.1004-6194.2014.01.026.

[8]Le Rouzic O,Pichavant M,Frealle E,et al.Th17 cytokines:novel potential therapeutic targets for COPD pathogenesis and exacerbations[J].Eur Respir J,2017,50(4).1602434.doi:10.1183/13993003.02434-2016.

[9]McGuinness AJ,Sapey E.Oxidative Stress in COPD:Sources,Markers,and Potential Mechanisms [J].J Clin Med,2017,6 (2).doi:10.3390/jcm6020021.

[10]Karlsson S,Backer V,Godtfredsen NS.Inflammation and COPD rehabilitation--the hen or the egg?[J].Clin Respir J,2013,7(3):e18-19.dois:http://dx.doi.org/10.1111/crj.12012.

[11]Mebratu YA,Tesfaigzi Y.IL-17 Plays a Role in RSV-induced Lung Inflammation and Emphysema in Elastase and LPS-injured Mice[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2018.doi:10.1165/rcmb.2017-0265OC.

[12]Fan C,Zhao Y,Yu Q,et al.Reversible Brain Abnormalities in People Without Signs of Mountain Sickness During High-Altitude Exposure[J].Sci Rep,2016,6:33596.doi:10.1038/srep 33596.

[13]董小銣,張向楠,李丹,等.紅景天苷對低壓低氧誘發(fā)大鼠腦損傷的保護(hù)作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2015,31(10):1327-1331.

[14]Terraneo L,Samaja M.Comparative Response of Brain to Chronic Hypoxia and Hyperoxia[J].Int J Mol Sci,2017,18(9).E1914.doi:10.3390/ijms18091914.

[15]Charriaut-Marlangue C,Besson VC,et al.Sexually Dimorphic Outcomes after Neonatal Stroke and Hypoxia-Ischemia[J].Int J Mol Sci,2017,19(1).E61.doi:10.3390/ijms19010061.

[16]Lenart N,Brough D,Denes A.Inflammasomes link vascular disease with neuroinflammation and brain disorders[J].J Cereb Blood Flow Metab,2016,36:1668-1685.doi:10.1177/0271678 X16662043.

[17]Selmi C,Barin JG,Rose NR.Current trends in autoimmunity and the nervous system[J].J Autoimmun,2016,75:20-29.doi:org/10.1016/j.jaut.2016.08.005.

[18]Strunk T,Inder T,Wang X,et al.Infection-induced inflammation and cerebral injuryinpreterm infants[J].Lancet Infect Dis,2014,14(8):751-762.doi:10.1016/S1473-3099(14)70710-8.

[19]Durazzo TC,Cardenas VA,Studholme C,et al.Non-treatment-seeking heavy drinkers:effects of chronic cigarette smoking on brain structure.Drug and alcohol dependence[J].2007,87(1):76-82.doi:10.1016/j.drugalcdep.2006.0803.

[20]李華.香煙煙霧吸入對大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及Fas蛋白表達(dá)的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué),2013,11:29.

[21]鄧娟,王延江,張猛,等.吸煙對阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能和海馬神經(jīng)元病理變化的影響 [J].中華老年心腦血管病雜志,2011,13(1):72-74.

[22]Michaud SE,Ménard C,Guy LG,et al.Inhibition of hypoxia-induced angiogenesis by cigarette smoke exposure:impairment of the HIF-1alpha/VEGFpathway[J].FASEBJ,2003,17(9):1150-1152.doi:10.1096/fj.02-0172fje.