王璐萍 陶潞淵 黃凱宇 宋喜發(fā) 張素勤 殷日鵬

研究發(fā)現(xiàn)，倒班工作人群的自身晝夜節(jié)律受到嚴(yán)重影響[1-3]，而維持正常的晝夜節(jié)律是保證心血管系統(tǒng)正常運行的基礎(chǔ)[4-7]。Fujino等[8]報道，在日本工廠，倒班人群和固定上白班的人群相比其發(fā)生缺血性心臟病的風(fēng)險顯著增加。另有動物實驗證實，短時間影響心肌梗死后小鼠晝夜節(jié)律，其遠期心臟結(jié)構(gòu)將發(fā)生改變，導(dǎo)致遠期心功能惡化[9]。目前已有研究表明，晝夜節(jié)律影響缺血再灌注損傷[10]，但相關(guān)的機制研究不多。因此有必要對晝夜節(jié)律紊亂和缺血再灌注損傷之間的機制進行進一步探索。目前研究認(rèn)為，炎癥因子是參與心肌缺血再灌注損傷的一個重要因素[11]，局部炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是缺血性心肌病不斷進展的罪魁禍?zhǔn)?。同時已有研究顯示，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）可以有效調(diào)控缺血性心肌病心肌炎癥細(xì)胞因子的釋放[12]。

我們的前期研究已證實，4周的黑暗環(huán)境暴露能影響小鼠的晝夜節(jié)律，并且使小鼠心肌組織MIF的表達下降，因此我們設(shè)計此實驗，通過檢測比較晝夜節(jié)律紊亂小鼠及正常節(jié)律小鼠缺血再灌注損傷前后心肌MIF、炎癥因子表達和心功能等，進一步研究MIF及炎癥因子在晝夜節(jié)律改變小鼠心臟缺血再灌注損傷中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 8周齡大的C57BL/6雄性小鼠36只，體質(zhì)量20～23g（購自上海史萊克實驗動物中心），均先在12h光照/黑暗周期環(huán)境中[溫度（22 ±1°C），光照上午 6：00開始，200～220lux光照強度]飼養(yǎng)2周。本研究所有實驗過程均嚴(yán)格遵守中國實驗動物福利法并經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物使用倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 儀器和試劑 超聲儀（ACUSON Sequoia 512，德國西門子公司），動物心電血壓記錄儀（美國Labchat公司），MIF單克隆抗體（英國Abcam公司），IL-6（美國RD公司），TNF-α、IL-8單克隆抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將36只小鼠在12h光照/黑暗周期環(huán)境中飼養(yǎng)2周后稱重，按體重大小編號，通過隨機數(shù)字表隨機分為4組，每組9只。其中兩組繼續(xù)飼養(yǎng)在12h光照/黑暗周期環(huán)境中（正常節(jié)律組），另兩組飼養(yǎng)在24h持續(xù)黑暗的環(huán)境中（節(jié)律紊亂組），每周清理鼠籠1次，正常節(jié)律組小鼠白天清理，節(jié)律紊亂組小鼠在微弱紅光（1～2lux）下清理，持續(xù)4周時間。正常節(jié)律組飼養(yǎng)4周后一組行缺血再灌注處理，設(shè)為Normal缺血再灌注組，另一組直接行MIF蛋白、炎癥因子、心功能等檢測，設(shè)為為Normal組。節(jié)律紊亂組飼養(yǎng)4周后一組也行缺血再灌注處理，設(shè)為Disrupted缺血再灌注組，另一組直接行MIF蛋白、炎癥因子、心功能等檢測，設(shè)為Disrupted組。

1.3.2 心臟缺血再灌注 Normal缺血再灌注組及Disrupted缺血再灌注組小鼠均用異氟烷吸入麻醉后，行氣管插管，用小鼠呼吸機（Harvard)進行機械通氣，用加熱板維持小鼠體溫37°C，開胸，在左心耳下方2mm處用7-0尼龍線結(jié)扎前降支，結(jié)扎30min后松開結(jié)扎線，逐層關(guān)閉胸腔，移除小動物呼吸機，置于電熱毯保溫，待小鼠麻醉蘇醒后繼續(xù)飼養(yǎng)至原環(huán)境中3d。

1.3.3 心臟超聲檢查 Normal組及Disrupted組小鼠飼養(yǎng)4周后行心超檢查，Normal缺血再灌注組及Disrupted缺血再灌注組小鼠缺血再灌注處理后繼續(xù)飼養(yǎng)3d再行心超檢查。在2%異氟烷的吸入麻醉下行經(jīng)胸心臟超聲檢查，測左心室舒張末內(nèi)徑（Left Ventricle End Diastolic diameter，LVEDd）、左心室收縮末內(nèi)徑（Left Ventricle End Systolic diameter，LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（1eft ventricle ejective fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。所有數(shù)據(jù)由1位不了解分組且經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員測量至少3個連續(xù)的心臟周期。

1.3.4 HE染色 各組小鼠在超聲檢查后水合氯醛鈉（100mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉,經(jīng)夾捏后爪判斷小鼠處于麻醉狀態(tài)后行頸椎脫臼法處死，取部分心肌組織固定、脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色壓片，顯微鏡下觀察心臟病理形態(tài)以及炎癥細(xì)胞分布情況。

1.3.5 Western blot法檢測 各組取心肌組織各約50mg置于裂解緩沖液中勻漿，裂解心肌組織獲取蛋白后，用二喹啉甲酸（BCA）比色法測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉 2～3h，加入一抗 4℃孵育過夜（至少16h），Tris鹽酸緩沖液（TBST）洗滌5次，再分別加入二抗稀釋液中室溫孵育2h，將二抗孵育結(jié)束的PVDF膜取出，TBST洗滌5次，增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光，曝光儀器中顯影，采用AlhaimagerTM2200圖像分析系統(tǒng)進行處理，Quantity one 4.0軟件進行分析,測定每一個目的條帶及內(nèi)參蛋白（GAPDH）的吸光度值，并分別以MIF、IL-6、TNF-α、IL-8的光密度值與其對應(yīng)的GAPDH光密度值之比表示其蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 飼養(yǎng)4周后Normal組和Disrupted組小鼠體重心超檢查結(jié)果和心肌MIF表達變化 經(jīng)過4周持續(xù)黑暗環(huán)境暴露后，蛋白印跡顯示∶Disrupted組小鼠心肌MIF蛋白的表達較 Normal組小鼠顯著降低（a、b）；Disrupted組小鼠和Normal組小鼠體重（c）無差異；Disrupted組小鼠和Normal組小鼠心超檢查結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（d-h）。見圖1。

圖1 飼養(yǎng)4周后Normal組和Disrupted組小鼠體重心功能和心肌MIF表達變化（與Normal組相比，*P＜0.05）

2.2 飼養(yǎng)4周后4組小鼠心臟炎癥因子表達的比較 Disrupted 組小鼠心肌 IL-6、TNF-α、IL-8 的表達高于 Normal組小鼠；Disrupted缺血再灌注組心肌IL-6、TNF-α、IL-8的表達顯著高于Normal缺血再灌注組，均P＜0.05（a-d）。見圖2、3。

由圖3可見，HE染色結(jié)果顯示：Disrupted缺血再灌注組心肌的炎癥浸潤程度顯著高于Normal缺血再灌注組。

2.3 Normal缺血再灌注組與Disrupted缺血再灌注組心功能比較見圖4。

由圖4可見，和Normal缺血再灌組相比，Disrupted缺血再灌注組心功能受損更嚴(yán)重，LVEDd和LVESd顯著增加（均P＜0.05），LVEF和LVFS顯著下降（均P＜0.05）。

3 討論

近年來作息規(guī)律差、晝夜顛倒、倒班、晚睡的人群不斷增加，這些人的自身晝夜節(jié)律已長時間受影響。2012的一項薈萃分析表明，倒班人群的心肌梗死相對風(fēng)險是1.23，發(fā)生心血管事件的相對風(fēng)險是1.41[13]。PCI目前已成為冠心病主要治療手段，特別是在急性心肌梗死患者中，急診PCI是冠脈血管再通的主要手段，能顯著降低急性心梗病死率和改善患者心臟功能。但再灌注損傷仍是不可回避的問題，再灌注導(dǎo)致心肌氧自由基增加，鈣超載，線粒體膜通透性增加、能量代謝紊亂、加重局部的炎癥反應(yīng)，促進細(xì)胞的凋亡[14-15]。

圖2 飼養(yǎng)4周后4組小鼠心臟炎癥因子表達的比較（與Normal組比較，*P＜0.05；與 Normal缺血再灌注組比較，△P＜0.05；與Disrupted 組比較，▲P＜0.05）

圖3 飼養(yǎng)4周后4組小鼠心肌組織病理檢查結(jié)果比較

圖4 Normal缺血再灌注組與Disrupted缺血再灌注組心功能比較（a:M型超聲心動圖；b-e:LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS；與Normal缺血再灌注組比較，*P＜0.05）

炎癥反應(yīng)的加重是心臟缺血再灌注損傷加重的重要原因，伴隨著再灌注血流，滲漏的中性粒細(xì)胞和促炎因子到達缺血部位[16-17]，炎癥因子IL-1β和TNF-α可以直接作用于心肌細(xì)胞上，加重心肌損傷[18-19]，TNF-α和IL-6可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞分泌可溶性促炎因子C5a、甲酰肽、血小板活化因子[20]。滲漏的中性粒細(xì)胞通過彈性蛋白酶、蛋白水解酶、超氧自由基等加重心肌損傷[20-22]。心臟缺血再灌注后，缺血心肌IL-8的水平在再灌注1h后就開始上升，并持續(xù)24h至數(shù)天，另外，重組的IL-8可以增加中性粒細(xì)胞對心肌細(xì)胞的黏附性，直接損傷心肌[23]。急性心肌梗死激發(fā)區(qū)域性和系統(tǒng)性先天免疫反應(yīng)是心肌愈合過程必不可少的，但區(qū)域性的過度炎癥反應(yīng)可增加組織損傷促進心肌細(xì)胞死亡[24]。

c-Jun氨基末端激酶（JNK）是絲裂原活化蛋白激酶家族的一員，能控制炎癥、增殖、細(xì)胞分化與凋亡。JNK主要通過增加Bcl-2家族Bad蛋白的去磷酸化來調(diào)控炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[24]。目前研究已證實在心肌缺血再灌注損傷中，MIF可以通過上調(diào)BAD的磷酸化抑制JNK調(diào)節(jié)的信號通路，減少心肌梗死面積[25]。用MIF基因敲除的小鼠發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注中，MIF的缺失能激活JNK活性增加肌心梗死面積，這一作用能被外源性重組MIF逆轉(zhuǎn)。即使使用茴香霉素激活心肌細(xì)胞JNK通路，使其發(fā)生磷酸化，JNK的活性仍可以被外源性加入的重組MIF蛋白所抑制[25]。可見MIF在心臟缺血再灌注中具有抗炎抗凋亡作用。

此外，晝夜節(jié)律失調(diào)影響小鼠免疫組織（胸腺、脾臟、腹腔巨噬細(xì)胞）的核心時鐘基因節(jié)律，導(dǎo)致脂多糖誘導(dǎo)的血液炎癥因子水平升高[26]。短期打亂心肌梗死小鼠的晝夜節(jié)律，導(dǎo)致其血漿中的IL-6水平和心肌IL-6mRNA的表達情況和正常小鼠相比均發(fā)生不同程度的變化[9]。心肌梗死區(qū)急性期炎癥的反應(yīng)有利于心肌的存活和修復(fù)，然而持續(xù)高水平的炎癥反應(yīng)反而損傷心肌增加纖維化，影響心肌的修復(fù)[27-29]。

我們用4周時間的黑暗環(huán)境暴露來打亂小鼠的晝夜節(jié)律，實驗結(jié)果顯示持續(xù)黑暗（Disrupted組）小鼠心肌MIF的表達顯著下降，同時心肌炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-8較晝夜交替（Normal組）顯著升高，經(jīng)過缺血再灌注處理后持續(xù)黑暗小鼠心臟的炎癥因子表達較晝夜交替小鼠缺血再灌注情況下更高。已有研究表明炎癥因子是參與心肌缺血再灌注損傷的一個重要因素[19,20]，這和我們的研究結(jié)果是一致的。打亂小鼠的晝夜節(jié)律使全身免疫功能失調(diào)，導(dǎo)致心肌MIF表達的水平下降，同時心肌炎癥因子水平增高，心臟缺血再灌注后，MIF抗炎作用下降，增加心肌局部IL-6、TNF-α、IL-8等炎癥因子的表達水平，加重的炎癥反應(yīng)增加局部組織損傷促進心肌細(xì)胞壞死，使心功能受損加重。

綜上所述，我們實驗證實了長時間的黑暗環(huán)境暴露打亂了小鼠的晝夜節(jié)律，并且進一步導(dǎo)致小鼠心臟缺血再灌注損傷加重。其中的機制可能是通過下調(diào)心肌局部MIF蛋白的表達，從而增加心臟缺血再灌注后IL-6、TNF-α、IL-8等炎癥因子水平，加重心肌局部炎癥反應(yīng)，加重心功能損傷。

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