張小英 俞莎莎 陳文采 陳曉峰 任劍飛

單純收縮性高血壓（isolated systolic hypertension,ISH）是一種由環(huán)境與遺傳因素相互作用所致的疾病，也是導(dǎo)致腦卒中、充血性心力衰竭、冠心病、腎功能衰竭的發(fā)病率和病死率升高的主要危險(xiǎn)因素之一，但其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)，隨著對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的深入研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、成纖維細(xì)胞增生以及介導(dǎo)心血管疾病的發(fā)生起著重要作用[1-2,4]。TGF-β1 通過(guò)與受體 2（transforming growth factor-β1 receptor 2,GFBR2）的結(jié)合,磷酸化Smads啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，在血管結(jié)構(gòu)和功能病變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。很多研究表明，TGF-β1、TGFBR2存在基因多態(tài)性，與原發(fā)性高血壓的易感性及發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[1-3]，而與ISH的關(guān)系尚不清楚。本研究從遺傳學(xué)的角度出發(fā)，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRRFLP）技術(shù)，通過(guò)病例-對(duì)照研究，分析TGF-β1基因的-869T/C位點(diǎn)，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點(diǎn)的基因多態(tài)性與ISH的相關(guān)性，為ISH的預(yù)防、診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 2014年2月至2015年2月在寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院心內(nèi)科住院的高血壓患者及健康體檢者中,符合1999年WHO/ISH的診斷標(biāo)準(zhǔn)（收縮壓≥140mmHg,舒張壓＜90 mmHg）的ISH患者103例。以患者在3個(gè)不同時(shí)間安靜狀態(tài)下測(cè)量血壓的平均值為準(zhǔn)。同時(shí)排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、先天性心臟病、風(fēng)濕性心瓣膜病、糖尿病、腎病等?；颊呔鶡o(wú)長(zhǎng)期飲酒嗜好，無(wú)肝、膽、胰、脾、肺、腎及內(nèi)分泌、自身免疫性疾病。另以病史、體格檢查、心臟B超等檢查無(wú)異常的169例健康者為對(duì)照組，兩組臨床資料中僅收縮壓的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見(jiàn)表1。以上研究對(duì)象均為漢族人群（無(wú)血緣關(guān)系），均對(duì)本研究知情同意。

表1 兩組對(duì)象臨床資料的比較

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 清晨空腹采集靜脈血,EDTA抗凝,按照寶生物工程（大連）有限公司血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。取A260/280比值為1.7～2.0的DNA標(biāo)本用于后續(xù)PCR-RFLP基因分型研究。

1.2.2 PCR-RFLP聯(lián)合測(cè)序法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性 根據(jù)Genebank基因庫(kù)序列信息，在TGF-β1基因的-869T/C位點(diǎn)，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點(diǎn)及其側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。引物參照文獻(xiàn)及使用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)，引物由上海捷瑞生物公司合成。PCR擴(kuò)增獲得特異性產(chǎn)物。

1.2.3 基因型鑒定 取適量PCR產(chǎn)物行限制性內(nèi)切酶消化，37℃溫育16h，終止酶切反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。對(duì)其中部分基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行膠回收、過(guò)柱純化,送上海生工生物公司作DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，并采用logistic回歸進(jìn)行多因素分析，計(jì)算OR（95%CI）值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1基因的-869T/C位點(diǎn)、TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點(diǎn)的測(cè)序圖運(yùn)用PCR-RFLP聯(lián)合測(cè)序法檢測(cè)TGFβ1基因的-869T/C位點(diǎn)，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點(diǎn)的基因多態(tài)性，見(jiàn)圖1。

圖1 TGF-β1基因的-869T/C位點(diǎn)、TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點(diǎn)的測(cè)序圖

2.2 TGF-β1基因型和等位基因頻率分布

表2 兩組TGF-β1基因的-869T/C位點(diǎn)的多態(tài)性分布［例（%）］

由表2可見(jiàn)，ISH組TGF-β1基因-869T/C各位點(diǎn)與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05)。

2.3 TGFBR2的基因型和等位基因頻率分布見(jiàn)表3～4。

表3 兩組TGFBR2基因的-3779A/G位點(diǎn)的多態(tài)性分布［例（%）］

表4 兩組TGFBR2基因的-1444C/G位點(diǎn)的多態(tài)性分布［例（%）］

由表3、4可見(jiàn)，ISH組TGFBR2基因的-3779A/G、1444C/G各位點(diǎn)與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

3 討論

ISH的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，TGF-β是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、基質(zhì)生成和組織修復(fù)的多潛能生長(zhǎng)因子,能促進(jìn)膠原、纖維連接素、層黏素等多種蛋白多糖合成。研究表明TGF-β1可能與高血壓有關(guān)，尤其是位于信號(hào)肽序列區(qū)第1外顯子的869T/C的基因多態(tài)性，大多研究表明C等位基因可能是高血壓的危險(xiǎn)因素[4-6]。TGF-β1通過(guò)與TGFBR2的結(jié)合發(fā)揮作用，許多研究提示TGFBR2基因與心血管疾病相關(guān)，如心臟驟停、Marfan syndrome、先天性心臟病等[7-9]。在Huang等[9]的最新研究中，發(fā)現(xiàn)TGFBR2基因上的-3779A/G位點(diǎn)和-1444C/G位點(diǎn)與中國(guó)人群的先天性心臟病有關(guān)聯(lián)。而心血管疾病與高血壓密切相關(guān)。因此在我們此次對(duì)ISH的研究中，主要對(duì)TGF-β1基因的869T/C位點(diǎn)，以及TGFBR2基因上的-3779A/G位點(diǎn)和-1444C/G位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序研究其單核苷酸多態(tài)性，進(jìn)一步闡明TGF-β1與ISH之間的關(guān)系。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1基因的869T/C單核苷酸多態(tài)性與ISH之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其實(shí)在不同人群中，TGF-β1基因的869T/C基因多態(tài)性與高血壓的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果存在爭(zhēng)議。早在2002年日本學(xué)者Yamada等[10]的研究表明TGF-β1基因的869T/C多態(tài)性與高血壓無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但C等位基因與日本女性高血壓顯著相關(guān)，而與日本男性高血壓不相關(guān)，這提示基因多態(tài)性不僅存在種族、民族及地域的差異[11]，也可能受性別影響。在研究TGF-β1基因的869T/C單核苷酸多態(tài)性與新疆漢族原發(fā)性高血壓的關(guān)系中，發(fā)現(xiàn)兩者缺乏關(guān)聯(lián)[12]。本研究也提示TGF-β1基因的869T/C位點(diǎn)多態(tài)性可能不是ISH發(fā)病的重要影響因素，可能與本研究樣本量小，且性別沒(méi)有排除有關(guān)。

本研究中，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G這2個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與ISH也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在陳金鳳等[13]的研究中提示TGFBR2基因的-1444C/G位點(diǎn)與原發(fā)性高血壓有關(guān)聯(lián)，按年齡、性別、吸煙、飲酒等因素進(jìn)行分層分析結(jié)果顯示，在≥55歲人群中，攜帶突變G等位基因型（CG+GG）者高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)增加，而-3779A/G位點(diǎn)基因型、等位基因型與高血壓的關(guān)聯(lián)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果與其不一致，在本研究中，TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G這2個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與ISH無(wú)關(guān)聯(lián)。我國(guó)漢族人群ISH組與對(duì)照組的TGF-β1基因的869T/C基因型與等位基因頻率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且TGFBR2基因的-3779A/G和-1444C/G位點(diǎn)的多態(tài)性與ISH也并無(wú)明顯相關(guān)聯(lián)?？赡芘c下面的因素相關(guān)：首先，研究樣本偏少，研究數(shù)量有限；其次，由于時(shí)間、經(jīng)費(fèi)的限制，沒(méi)有測(cè)定血漿TGF-β1、TGFBR2含量，無(wú)法得知基因多態(tài)性對(duì)其含量的影響；再次，沒(méi)有對(duì)樣本按性別、年齡、吸煙等因素分層進(jìn)行深入分析，且血壓遺傳度、單核苷酸多態(tài)性在不同人群中分布頻率有差異，可能導(dǎo)致基因雜合程度的差異。

我們期待將來(lái)能有更大樣本、更全面的關(guān)于ISH分子遺傳學(xué)研究，為診斷、治療及預(yù)防提供更好的思路。

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