蔣紅，賈艾敏，王麗恒，邱亞，青玉鳳，蔡燕，楊明輝,

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，1.風(fēng)濕免疫研究所；2.醫(yī)學(xué)研究中心；3.檢驗科；4.風(fēng)濕免疫科，四川 南充 637000)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于嘌呤代謝紊亂，導(dǎo)致尿酸生成過多而誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的炎癥性疾病，由先天性嘌呤代謝障礙和尿酸排泄減少所致的痛風(fēng)稱為原發(fā)性痛風(fēng)。盡管痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，但越來越多的證據(jù)顯示原發(fā)性痛風(fēng)60%與遺傳因素有關(guān)，且約90%原發(fā)性痛風(fēng)和高尿酸血癥是由于尿酸排泄減少所致[1-2]。三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ATP-binding cassette,sub-family G,member 2，ABCG2)是一個高容量的尿酸分泌型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在近曲小管的管腔膜側(cè)表達(dá)，必須形成同型二聚體才能發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸的活性，研究表明ABCG2 蛋白主要參與腎臟尿酸的分泌[3]。其單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs2231142位點變異引起ABCG2蛋白的141位的谷氨酸(Q)變成賴氨酸(K)，尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性較野生型明顯下降，進(jìn)而引起血尿酸明顯升高，導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)生[3]。

研究表明，ABCG2蛋白rs2231142(A/C)基因多態(tài)性與痛風(fēng)的發(fā)生密切相關(guān)，且rs2231142多態(tài)性的分布具有明顯的地域性和人群差異性特征[3-6]。本實驗對川東北地區(qū)男性痛風(fēng)患者ABCG2基因rs2231142多態(tài)性與痛風(fēng)的相關(guān)性進(jìn)行研究，為該地區(qū)原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗選取2013年1月至2015年12月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕血液科診斷為原發(fā)性痛風(fēng)的175例男性患者作為病例組，年齡18～85歲，平均年齡(47.8 ±13.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1977年美國風(fēng)濕病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；排除標(biāo)準(zhǔn)：排除近期服用可能導(dǎo)致尿酸升高藥物的患者，排除任何可能導(dǎo)致尿酸升高的疾病，排除因嘌呤代謝酶導(dǎo)致的尿酸代謝缺陷[8-9]。同時，選取無高尿酸血癥及痛風(fēng)既往史和家族史，無其它自身免疫性疾病，與病例組年齡、性別、職業(yè)特點無明顯差異的277例健康體檢者作為對照組，年齡 23～78歲，平均年齡(46.5±12.8)歲。

1.2 外周血DNA提取

用EDTA抗凝管抽取175例痛風(fēng)患者和277例健康對照人群的靜脈血3 mL，室溫反應(yīng)30 min，分離血漿，將剩余血液成分按每管500 uL進(jìn)行分裝，做好標(biāo)記，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们皩龃娴难河?7 ℃水浴溶解，用天根的血液DNA提取試劑盒(離心柱法)提取外周血DNA，按試劑盒說明書進(jìn)行外周血DNA提?。挥肞ultton P200+超微量分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量，OD260/OD280=1.8～2.0表示DNA提取效果較好，可用于Taqman-MGB探針法SNP分型。

1.3 Taqman-MGB探針法檢測rs2231142位點多態(tài)性

從ABI公司購買rs2231142位點對應(yīng)的Taqman-MGB探針，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)Taqman-MGB探針法檢測樣本SNP位點基因型及等位基因頻率：只檢測到VIC信號，表明所測樣本基因型為CC型；只檢測到FAM信號，表明所測樣本基因型為AA型；同時檢測到VIC信號和FAM信號，表明基因型為CA型。反應(yīng)體系5 μL：TaqMan Universal PCR Master Mix (2×)2.50 μL，40×SNP Genotyping Assay 0.25 μL，模板DNA 1 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；擴(kuò)增在ABI QuantStudio 12K熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

按照Taqman-MGB探針說明書統(tǒng)計實驗結(jié)果，hardy-weinberg平衡檢測對照組的群體代表性，P>0.5，表明所選樣本具有群體代表性；P<0.5，表明所選樣本不具有群體代表性。用χ2檢驗分析病例組與對照組的基因型和等位基因型差異，分析結(jié)果用OR值和95%的置信區(qū)間(95% CI)表示；P<0.05，表示差異具有顯著性；P<0.01，表明差異極顯著。SHEsis在線分析軟件用于結(jié)果統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取質(zhì)量檢測

OD260/OD280=1.8～2.0表示DNA提取質(zhì)量良好，且用于Taqman-MGB探針法SNP分型效果好。對于OD260/OD280<1.8，說明樣品中酶和蛋白含量過高，應(yīng)將樣品用酚、氯仿、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；OD260/OD280>2.0，說明樣本中RNA含量過高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA。或者用分裝的血液標(biāo)本進(jìn)行二次抽提，保證DNA提取質(zhì)量滿足分型要求。

2.2 基因分型檢測結(jié)果

Taqman-MGB探針法檢測ABCG2基因rs2231142位點SNP分型，結(jié)果如圖1所示：紅點表示只檢測到熒光信號VIC，所測樣本基因型為CC型；藍(lán)點表示只檢測到熒光型號FAM，所測樣本基因型為AA型；綠點表示同時檢測到熒光信號VIC和FAM，所測樣本基因型為CA型。根據(jù)熒光信號分布情況，初步判斷突變型AA基因型和A等位基因在原發(fā)性痛風(fēng)患者中的分布頻率更高。

2.3 兩組基因型和等位基因型頻率分布的分析

對175例痛風(fēng)患者和277例健康人進(jìn)行SNP分型分析，所得結(jié)果進(jìn)行hardy-weinberg平衡檢測，檢測結(jié)果顯示對照組P=0.92，符合hardy-weinberg遺傳平衡，具有群體代表性。進(jìn)一步分析顯示(表1)，rs2231142位點CC基因型，在痛風(fēng)組中分布頻率為35.4%，對照組中分布頻率為46.9%；CA雜合型在痛風(fēng)組中分布頻率為41.7%，對照組為43.0%；AA型在痛風(fēng)組中分布頻率為22.9%，對照組為10.1%；各基因型分布頻率在痛風(fēng)患者和正常人群之間差異極顯著(P<0.01)。rs2231142位點等位基因A在痛風(fēng)患者中的攜帶頻率顯著高于正常人群,分別為43.7%和31.6%(P<0.01),OR值為1.682(1.275～2.218)。實驗結(jié)果提示：rs2231142多態(tài)性與川東北地區(qū)男性原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病相關(guān)，A等位基因和AA基因型為痛風(fēng)發(fā)病的易感因素，C等位基因和CC型為痛風(fēng)發(fā)病的保護(hù)機(jī)制。

表1 rs2231142位點基因型和等位基因型頻率分布比較[n(%)]

3 討論

2017我國痛風(fēng)患者已經(jīng)超過8 000萬，且呈現(xiàn)發(fā)病率增高，發(fā)病年輕化的趨勢，痛風(fēng)已成為我國僅次于糖尿病的第二類代謝性疾病。痛風(fēng)以男性發(fā)病為特征，男性患者占80%以上，發(fā)病年齡一般在45歲左右。痛風(fēng)的發(fā)病與患者不健康的飲食習(xí)慣(高熱量、高脂肪、高嘌呤食物攝入過多)和生活習(xí)慣(熬夜、不運(yùn)動、不節(jié)制飲酒等)相關(guān)[10]，此外，遺傳因素是原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)病的主要原因。痛風(fēng)不僅引發(fā)關(guān)節(jié)損傷，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作可形成痛風(fēng)結(jié)節(jié)和轉(zhuǎn)變?yōu)槁酝达L(fēng)性關(guān)節(jié)炎，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙和造成骨破壞，晚期還可能導(dǎo)致痛風(fēng)性腎病及腎功能衰竭，最終引起死亡。痛風(fēng)不僅累及關(guān)節(jié)和腎臟，而且可誘發(fā)和加重現(xiàn)代流行病如糖尿病、冠心病、高血壓及腦血管疾病的的發(fā)生和發(fā)展，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9-10]。探索痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)早期診斷標(biāo)志和治療靶點，對痛風(fēng)的治療至關(guān)重要。

原發(fā)性痛風(fēng)與嘌呤代謝異常和尿酸排泄減少相關(guān) ,腎臟尿酸排泄減少的相關(guān)基因包括有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(OAT1)基因、尿酸鹽陰離子交換器(hURATI)基因、人葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(GLUT9)基因和三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ABCG2)基因等[11-13]。研究表明，ABCG2主要參與腎臟尿酸的分泌，體外實驗證實SNP rs2231142位點變異引起ABCG2蛋白的141位的谷氨酸(Q)變成賴氨酸(K)(Q141K)，使ABCG2蛋白多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變，引起尿酸升高，導(dǎo)致痛風(fēng)的發(fā)生[3]。本實驗以川東北地區(qū)男性原發(fā)性痛風(fēng)患者為研究對象，通過Taqman-MGB探針法檢測ABCG2基因 rs2231142位點多態(tài)性與痛風(fēng)的關(guān)系。實驗結(jié)果表明，痛風(fēng)組AA基因型和A等位基因的攜帶率顯著高于對照組，A等位基因攜帶者發(fā)病風(fēng)險是C等位基因攜帶者的1.682倍，A等位基因是原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)病的危險因素。據(jù)報告，rs2231142位點A等位基因型在不同人群中的分布不同[4,14-17]，對川東北地區(qū)男性痛風(fēng)患者的rs2231142位點進(jìn)行SNP分型分析，對揭示該地區(qū)原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，為將來擬進(jìn)行的靶向藥物治療痛風(fēng)篩選位點。

[1] 熊安,姚麒,余晶波.高尿酸血癥和痛風(fēng)易感基因單核苷酸多態(tài)性研究新進(jìn)展及應(yīng)用[J].寧波大學(xué)學(xué)報(理工版),2016,29(2)：116-120.

[2] Dehghan A,Kottgen A,Yang Q,etal.Association of three genetic loci with uric acid concentration and risk of gout: a genome-wide association study[J].Lancet,2008,372(9654):1953-1961.

[3] Woodward OM,Kottgen A,Coresh J,etal.Identification of a urate transporter,ABCG2,with a common functional polymorphism causing gout[J].PNS,2009,106(25):10338-10341.

[4] Wang B,Miao Z,Liu S,etal.Genetic analysis of ABCG2 gene C421A polymorphism with gout disease in Chinese Han male population[J].Hum Genet,2010,127(2):245-246.

[5] 李發(fā)貴,楚軼,孟冬梅,等.ABCG2基因第5外顯子C421A多態(tài)與中國漢族男性原發(fā)性痛風(fēng)的相關(guān)性研究[J].中華遺傳醫(yī)學(xué)雜志，2011,28(6):683-685.

[6] 邱亞,柳華,周京國,等.三磷酸腺苷結(jié)合盒亞家族G超家族第二個成員(ABCG2)基因rs2231142多態(tài)性與痛風(fēng)發(fā)病風(fēng)險的Meta分析[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2015，19(6):384-388.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會.原發(fā)性痛風(fēng)診斷和治療指南[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2011,15(6):410-413.

[8] 余家會,何霞,張蓓,等.新疆地區(qū)維吾爾族和漢族人群ABCG2基因rs2231142位點多態(tài)性與高尿酸血癥的相關(guān)性[J].臨床檢驗雜志,2015,33(2):142-146.

[9] 王婧宇,常寶成.高尿酸血癥/痛風(fēng)流行病學(xué)特點及危險因素[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志，2016,36(2):78-81,88.

[10] 關(guān)寶生,白雪,王艷秋,等.痛風(fēng)/高尿酸血癥患者生活習(xí)慣的危險因素[J].中國老年學(xué)雜志,2014,34(2):455-457.

[11] 董鵬,宋慧.痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,35(12):1695-1699.

[12] Kawamura Y,Matsuo H,Chiba T,etal.Pathogenic GLUT9 mutations causing renal hypouricemia type 2 (RHUC2)[J].Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,2011,30(12):1105-1111.

[13] Anthony,Reginato,David B,etal.The genetics of hyperuricaemia and gout[J].Nat Rev Rheumatol,2012,8(10):610-621.

[14] 王金丹,余玲玲,黃德益,等.ABCG2基因rs2231142位點多態(tài)性與浙南地區(qū)人群原發(fā)性痛風(fēng)的關(guān)系[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,36(4):503-507.

[15] Matsuo H,Takada T,Ichida K,etal.Common defect of ABCG2,a high capacity urate exporter cause gout: a function based genetic analysis in a Japanese population[J].Sci Transl Med,2009,1(5):5ra11.

[16] Chang HY,Pan WH,Yeh WT,etal.Hyperuricemia and gout in Taiwan:results from the Nutritional and Health Survey in Taiwan (1993-96)[J].J Rheumatol,2001,28(28):1640-1646.

[17] Miao Z,Li C,Chen Y,etal.Dietary and lifestyle changes associated with high prevalence of hyperuricemia and gout in the Shandong coastal cities of Eastern China[J].J Rheumatol,2008,35(9):1859-1864.