楊勤，雍熙，李婷婷，余嫻，雷軍

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血管外科；3.川北醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，四川 南充 637000；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400010；5.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是臨床常見的多重耐藥菌之一，該菌對抗生素耐藥性呈逐年上升趨勢，臨床可選用的抗生素也越來越有限[1]。因此，研究者們將目光投向了針對該菌外膜蛋白F(OprF)的DNA疫苗。有研究表明OprF同時具有B細胞表位及T細胞表位，能誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。但是，免疫反應(yīng)太弱限制了對其的進一步研究[2-3]。I型單皰病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)間層蛋白VP22是一種高效的細胞穿透肽(CPPs)[4]，有研究[5-6]表明與VP22蛋白融合表達后，抗原蛋白能誘導(dǎo)更強的免疫反應(yīng)，彌補裸露DNA疫苗免疫原性差的缺點。本研究通過構(gòu)建OprF/VP22融合表達的真核質(zhì)粒，驗證重組質(zhì)粒在真核細胞內(nèi)的表達，為進一步研究重組DNA疫苗的體內(nèi)免疫反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

銅綠假單胞菌(ATCC27853)及非洲綠猴腎細胞系Vero由本實驗室保存；6～8周齡BALB/c雌性小鼠購自川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心；pGEX-C45(pGEX-5X-1與編碼VP22蛋白碳端的257-301氨基酸殘基的基因片段的連接)和pcDNA3-VP22(pcDNA3與HSV-1編碼VP22蛋白的UL49基因的連接，酶切位點為EcoRI，)由余嫻教授惠贈[7]；PVAX1真核表達質(zhì)粒購自贏潤生物公司；BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ購自fermentas公司；Quick T4 DNA Ligase購自Cell Biolabs公司；引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、抗OprF抗血清(兔源性)以及pVAX1-OprF-VP22和pVAX1-VP22-OprF的具體構(gòu)建由上海生物工程公司完成；HRP標記的羊抗小鼠/兔IgG、抗β-Actin小鼠單克隆抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、DAB顯色試劑盒、苯甲基磺酰胺、內(nèi)參Actin抗體、Western Blot試劑盒購自Beyotime公司；質(zhì)粒提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix購自北京天根公司；蛋白酶K購自BIO BASIC公司；溶菌酶購自Merck公司；TtansIT-LT1 Reagent 2300購自Mirus公司；DL2,000DNA Marker、DNA片段回收試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白預(yù)染Marker購自Thermo公司；佐劑購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA疫苗載體的構(gòu)建 (1)pVAX1-OprF的構(gòu)建：首先提取銅綠假單胞菌(ATCC27853)的基因組，然后根據(jù)引物設(shè)計原則和編碼OprF蛋白的基因序列設(shè)計引物，上游引物P1：5′-CGCGGATCCAAGATGAAACTGAAGAACAC-3′(下劃線處為BamHI酶切位點)；下游引物P2:5′-CCGCGAATTCTTACTTGGCTTCAGCTTCT-3′(下劃線處為EcoRI酶切位點)，擴增片段大小1 053 bp。以銅綠假單胞菌基因組為模板，擴增編碼OprF的基因序列，擴增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min結(jié)束。PCR產(chǎn)物純化回收后，與質(zhì)粒pVAX1分別經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E。coliDH5α，經(jīng)Kana+(50 g/mL)抗性篩選陽性克隆，純化回收質(zhì)粒，雙酶切鑒定，并送測序。(2)pVAX1-VP22的構(gòu)建：直接用EcoRI單酶切pcDNA3-VP22，獲得編碼VP22蛋白的UL49基因，大小為906 bp，然后將其連入真核載體pVAX1，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)Kana+(50 g/mL)抗性篩選陽性克隆，純化回收質(zhì)粒，分別經(jīng)EcoRI及XhoI單酶切鑒定，并送測序。(3)pVAX1-VP22-OprF的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計原則和編碼VP22蛋白的基因序列設(shè)計引物，上游引物P3：5′-TATAAGCTTATGACCTCTCGCCGCTCCGT-3′(下劃線處為HindⅢ酶切位點)；下游引物P4：5′-AATTAGGATCCTAACTCGACGGGCCGTCTG-3′(下劃線處為BamHI酶切位點)，擴增片段大小906 bp。以pcDNA3-VP22為模板，擴增編碼VP22的基因序列。PCR產(chǎn)物純化回收后，與重組質(zhì)粒pVAX1-OprF分別經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)Kana+(50 g/mL)抗性篩選陽性克隆，純化回收質(zhì)粒，雙酶切及測序鑒定，具體操作由上海生物工程公司完成。(4)pVAX1-OprF-VP22的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計原則和編碼OprF蛋白的基因序列設(shè)計引物，上游引物P5：5′-GCCAAGCTTAGCATGAAACTGAAGAACAC-3′(下劃線處為HindⅢ酶切位點)；下游引物P6：5′-TCAATGGATCCACTTGGCTTCAGCTTCTA-3′(下劃線處為BamHI酶切位點)，擴增片段大小1 053 bp。以pVAX1-OprF為模板，擴增編碼OprF的基因序列。PCR產(chǎn)物純化回收后，與重組質(zhì)粒pVAX1-VP22分別經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切，T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)Kana+(50 g/mL)抗性篩選陽性克隆，純化回收質(zhì)粒，雙酶切及測序鑒定，具體操作由上海生物工程公司完成。

1.2.2 抗VP22抗血清的制備及鑒定 (1)GST-C45融合蛋白的誘導(dǎo)表達：將重組質(zhì)粒pGEX-C45和空載體pGEX-5X-1(作為對照)，分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DB3)，涂布于Amp+(100 g/mL)抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)；然后分別挑取pGEX-C45和pGEX-5X-1的單菌落于3 mL Amp+抗性的2YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)；以1∶20的比例接種于100 mL Amp+抗性的2YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)約3 h至OD 600達0.5～0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h；4 ℃、800 r/min離心10 min，沉淀用400 L的PBS(pH7.4)重懸，收集菌體。(2)GST-C45融合蛋白的分離純化：在上述收集到的菌液中加入溶菌酶及蛋白酶抑制劑，冰浴30 min后行超聲破碎(300 W，10 s 超聲，10 s間隔，30次循環(huán))，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分別收集上清液及沉淀包涵體。然后向收集到的沉淀包涵體中加入濃度為6 mol/L的尿素2 mL，42 ℃放置30 min，待蛋白溶解后8 000 r/min離心10 min，吸取上清。將兩次收集到的上清混合，以15 L分裝上清混合物，并加入等體積的2×裂解上樣buffer，沸水放置10 min后行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭染色，對照蛋白預(yù)染Marker，切取相應(yīng)大小的蛋白凝膠條帶放入已經(jīng)處理好的透析袋內(nèi)，加入適量1×Tris甘氨酸電泳緩沖液，兩端用夾子夾緊，4 ℃、100 V電泳3 h；反轉(zhuǎn)電壓正負極，4 ℃、100 V電泳1 min，吸取蛋白溶液，將-20 ℃預(yù)冷的5倍體積的丙酮緩慢加入蛋白溶液內(nèi)，-20 ℃放置30 min，4 ℃、12 500 r/min離心20 min，移去上清，待殘余丙酮揮發(fā)后用雙蒸水重懸沉淀，得到純化的融合蛋白；用BCA法測定純化后的VP22蛋白，濃度為320 g/mL，將其稀釋至200 g/ml，凍存于-70 ℃冰箱備用。(3)抗VP22抗血清的制備：隨機抽取10只BALB/c雌性小鼠，其中5只作為實驗組，5只作為對照組。實驗組首次免疫取100 g純化的融合蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化，然后腹部皮下多點免疫小鼠，初次免疫后的第2、4、6周取50 g純化的融合蛋白與弗氏不完全佐劑乳化加強免疫。對照組以生理鹽水代替純化后的融合蛋白免疫小鼠，其余條件不變。第4次免疫后7天眼內(nèi)眥取血。靜止離心后分離血清收集抗體。將實驗組收集到的血清命名為陽性血清，對照組收集到的血清命名為陰性血清。(4)Western blot檢測抗VP22抗血清：首先將收集到的陽性血清與純化后的GST-C45融合蛋白行Western blot檢測。以脂質(zhì)體法將pcDNA3-VP22轉(zhuǎn)染Vero細胞，RIPA裂解液提取總蛋白，用陽性抗血清作為一抗，進行Western blot檢測；同時取陰性血清為一抗作為對照。

1.2.3 Western blot檢測重組質(zhì)粒在真核細胞內(nèi)的表達 將實驗組分為pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22，以脂質(zhì)體法將分別將其轉(zhuǎn)染Vero細胞。轉(zhuǎn)染pVAX1-VP22時用抗VP22抗血清作為一抗，同時轉(zhuǎn)染pVAX1作為對照；轉(zhuǎn)染pVAX1-OprF、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22時以抗OprF抗血清作為一抗，同時轉(zhuǎn)染pVAX1作為對照。待培養(yǎng)瓶內(nèi)Vero細胞長至60～70時，分別取5 g重組質(zhì)粒pVAX1-OprF、pVAX1-VP22、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22與15 L TtansIT-LT1 Reagent 2 300加入500 L無血清無雙抗細胞培養(yǎng)液，混勻后室溫放置20 min，然后將形成的DNA脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶內(nèi)；同時轉(zhuǎn)染pVAX1作為參照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72 h，用RIPA裂解液提取細胞蛋白，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，Western封閉液1 h，一抗4 ℃搖床過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pVAX1-OprF經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后得到大小1 053 bp的目的基因條帶(圖1A)，DNA序列測定證實該重組真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

重組真核表達質(zhì)粒pVAX1-VP22經(jīng)EcoRⅠ酶切后得到大小為906 bp的片段(圖1B)，由于目的片段可以以正向或反向連入載體，依據(jù)載體及目的片段的酶切位點特性，選擇酶切位點XhoⅠ作進一步檢測。正向連接產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ酶切后可得到大小為75 bp和39 bp的條帶，電泳時由于分子量太小而不可見；反向連接產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ酶切后會出現(xiàn)大小為846 bp的條帶。實驗中以XhoⅠ單酶切重組質(zhì)粒pVAX1-VP22時并未觀察到反向連接時會出現(xiàn)的846 bp條帶(圖1C)，說明VP22基因片段正向連入了載體pVAX1。DNA序列測定證實該重組真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 抗VP22抗血清的制備及鑒定

2.2.1 融合蛋白的誘導(dǎo)表達及分離純化 將空載體pGEX-5X-1和重組質(zhì)粒pGEX-C45分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)表達菌，IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)12%SDS-PAGE分析表明，與空載體組相比，pGEX-C45額外表達了分子量大小約為30 kD的蛋白條帶，大小與預(yù)期一致(圖2A)。將重組質(zhì)粒的原核表達產(chǎn)物行12%SDS-PAGE電泳，切取相應(yīng)大小的蛋白凝膠條帶，電洗脫得到純化的GST-C45融合蛋白。經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后可得到單一且位置正確的條帶(圖2B)。BCA法測得純化的GST-C45融合蛋白濃度為320 μg/mL，將其稀釋至200 g/mL，用于免疫BALB/c小鼠制備抗VP22抗血清。

2.2.2 抗VP22抗血清的特異性鑒定 將純化后的GST-C45融合蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，以抗VP22抗血清為一抗，進行Western blot檢測，在分子量約30 kD處可見一特異性條帶，與預(yù)期一致，表明制備的抗VP22抗血清可特異性識別純化后的GST-C45融合蛋白(圖3A)。為了進一步驗證抗VP22抗血清的特異性，通過轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒pcDNA3-VP22，以抗VP22抗血清(陽性血清)為一抗，進行Westem blot檢測，在分子質(zhì)量約30 kD處可見一特異性條帶；以陰性血清作為一抗時則無特異性條帶產(chǎn)生(圖3B)。通過以上實驗證明：制備的抗VP22抗血清可特異性識別VP22蛋白，該抗血清可用于后續(xù)實驗中檢測重組真核質(zhì)粒在細胞內(nèi)的表達。

2.3 Western blot檢測重組質(zhì)粒的體外表達

Western blot結(jié)果顯示，將重組質(zhì)粒pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22 、pVAX1-VP22-OprF分別轉(zhuǎn)染真核細胞，在相對分子量35 kD處可見VP22蛋白的特異性條帶，在相對分子量37 kD處可見OprF蛋白的特異性條帶，以及在相對分子量70 kD處可見VP22-OprF和OprF-VP22融合表達的特異性蛋白條帶，而對照組無特異性條帶產(chǎn)生(圖4)。

3 討論

OprF是銅綠假單胞菌外模上的主要非特異性通道蛋白，在遺傳上具有高度保守性，免疫原性相對較強，是極具潛力的疫苗候選分子[8]。已有研究表明在人體試驗和動物模型中，OprF可誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，但免疫反應(yīng)太弱而無法預(yù)防細菌感染的發(fā)生。Price等[9]將OprF基因克隆至真核表達質(zhì)粒Pvr1020，成功構(gòu)建了Pvr 1 020/OprF DNA疫苗。在銅綠假單胞菌導(dǎo)致的小鼠慢性肺部感染的模型中，該重組質(zhì)粒可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，但是與空載體組相比保護力并無明顯差異。研究者們采取許多辦法以期增強OprF的免疫原性，如Westritschnig等[10]制備了銅綠假單胞菌OprF及OprI融合表達的DNA疫苗，免疫原性雖有所提高，但是免疫預(yù)防的效果仍有待提升。目前尚無防治銅綠假單胞菌感染的疫苗問世[11]。

在DNA疫苗的研究領(lǐng)域，細胞穿透肽VP22顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。VP22蛋白可將與融合的編碼特異性抗原的基因片段以高效跨膜的方式轉(zhuǎn)運至周圍的抗原提呈細胞，增強抗原的表達，誘導(dǎo)更強的免疫反應(yīng)[12]。Kim等[13]構(gòu)建了人乳頭瘤病毒E7基因與編碼HSV-1 VP22蛋白UL49基因融合表達的重組真核質(zhì)粒，將其免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，與只編碼E7基因的重組質(zhì)粒相比，融合表達后的DNA疫苗可引起更明顯的T淋巴細胞毒性反應(yīng)，說明VP22顯著增強了此DNA疫苗的免疫原性。

盡管已有研究表明VP22 羧基端是其發(fā)揮細胞間轉(zhuǎn)運功能的重要結(jié)構(gòu)域[4,14]，但是為了確保實驗的嚴謹性，排除蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)差異可能對疫苗免疫效果造成的影響，實驗中我們同時設(shè)計了pVAX1-OprF-VP22與pVAX1-VP22-OprF兩種重組DNA疫苗作為研究對象。而pVAX1-OprF與pVAX1-VP22的成功構(gòu)建，為整個實驗的順利進行奠定了基礎(chǔ)，在后續(xù)實驗中起到了很好的對照作用。另外，本研究利用原核表達載體pGEX-C45，誘導(dǎo)表達VP22碳端第257～301氨基酸殘基，獲得重組蛋白GST-C45抗原標準品，制備抗VP22抗血清，經(jīng)Western blot證實該多抗血清可與VP22蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。

本研究將pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22 、pVAX1-VP22-OprF依次轉(zhuǎn)染真核細胞，同時設(shè)置空載體pVAX1作為對照組。通過Western blot觀察到重組質(zhì)粒在細胞內(nèi)都得到了表達。pVAX1-VP22表達了相對分子量約35 kD的蛋白。pVAX1-OprF表達了相對分子量約37 kD的蛋白。而pVAX1-OprF-VP22和pVAX1-VP22-OprF都表達了相對分子量約70 kD的蛋白，與預(yù)期一致，推測此蛋白即為OprF與VP22融合表達的結(jié)果。這些結(jié)果均說明無論是VP22和OprF的單獨基因片段，還是二者的融合質(zhì)粒，都能在真核細胞中得到表達。但是pVAX1-OprF-VP22 與pVAX1-VP22-OprF是否能如預(yù)期一樣較pVAX1-OprF誘導(dǎo)更強的免疫反應(yīng)，以及誰才是最優(yōu)的疫苗分子，有待進一步的研究。

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