楊 毅，官俏兵，郭 麗，張曉玲，韓晨陽

(嘉興市第二醫(yī)院， 浙江 嘉興 314001)

缺血性腦卒中是一種急性腦缺血缺氧性疾病，可在短時間造成腦組織中血管閉塞，神經(jīng)細(xì)胞大量死亡，且預(yù)后較差，致死致殘率較高[1]。目前臨床中對于急性缺血性卒中的治療主要有急性期的溶栓治療和保守藥物治療。丁苯酞(DL-3-n-butylphthalidle，NBP)是從芹菜中提取的一種單體藥物?；A(chǔ)實驗證明丁苯酞可以有效抑制急性缺血性卒中腦損傷的多個病理環(huán)節(jié)，在缺血性腦病中有著廣泛的應(yīng)用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞還可以縮小梗死的病灶，其作用和微循環(huán)的改善有關(guān)[2-3]。對于卒中患者而言，側(cè)支血管的形成與開通無疑是有利于預(yù)后的，所以本研究著重研究丁苯酞在缺血缺氧(hypoxia and ischemia，H/I)條件下誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)形成血管的體外實驗，并探索其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和試劑

丁苯酞標(biāo)準(zhǔn)品購于中檢所，批號101035，純度99%；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購于武漢普諾賽生物科技有限公司(批號CL0122)；F12K完全培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生物科技有限公司(批號PM150910和PM150910B)；CCK-8試劑盒(批號AR1160)、 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的ELISA試劑盒(批號EK0539)和BCA蛋白定量試劑盒(批號0146)購于博士德生物技術(shù)有限公司；Matrigel購于BD公司(批號356234)；抗VEGF受體2(VEGF receptor 2, VEGFR2)、Notch1和Delta樣配體4(Delta-like ligand 4,Dll4)的I抗及HRP標(biāo)記的II抗購于Abcam(批號5473、65297和7280)；cDNA試劑盒購于凱基生物技術(shù)有限公司(批號KGA1311)；實時定量PCR試劑盒/SYBR Green Real-time PCR Master Mix購于SinoBio(批號E090);總RNA提取試劑盒購于BioTek(批號RP2041)。

2 方法

2.1細(xì)胞模型的構(gòu)建及分組 HUVECs使用含10% 胎牛血清的F12K完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待長至80%融合時消化后分組培養(yǎng)。將HUVECs分為正常對照(control)組、H/I組、NBP高劑量(H/I+NBPhigh)組和NBP低劑量(H/I+NBPlow)組。Control組使用F12K完全培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；H/I組和H/I+NBPhigh組和H/I+NBPlow組的3組細(xì)胞使用無血清的F12K培養(yǎng)基并置于缺氧罐中，氣體使用氮氣置換后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；H/I+NBPhigh組使用50 μmol/L終濃度的丁苯酞干預(yù)；H/I+NBPlow組使用10 μmol/L終濃度的丁苯酞干預(yù)。

2.2CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力 在培養(yǎng)后6、12、24和48 h 4個時點分別檢測細(xì)胞的活力。在每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A)值，同時設(shè)置空白對照。細(xì)胞活力(%)=(A實驗組-A空白對照)/(A對照組-A空白對照)×100%

2.3細(xì)胞劃痕實驗檢測HUVECs的遷移能力 將對數(shù)期的細(xì)胞接種在6孔板中，使其成為單層細(xì)胞，棄去常規(guī)培養(yǎng)基后用10 μL的移液槍在單層細(xì)胞上劃“一”字劃痕，PBS清洗3次，棄去懸浮的細(xì)胞后，換上含有丁苯酞的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在鏡下觀察細(xì)胞遷移的程度，利用ImageJ軟件進(jìn)行實驗前和實驗后細(xì)胞遷移率距離(S)測定和遷移率的計算。遷移率(%)=(1-S實驗后/S實驗前)×100%

2.4HUVECs體外形成血管的能力檢測 實驗前將融化的Matrigel置于冰上，在ibidi血管生成載玻片上每孔加入10 μL的Matrigel，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min待膠體凝結(jié)后每孔加入懸浮細(xì)胞1×104個左右，鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察成管情況，使用IPP 6.0圖像軟件測定血管總長度，鏡下的覆蓋面積，成環(huán)數(shù)以及節(jié)點，并統(tǒng)計分析。

2.5ELISA法檢測培養(yǎng)基中VEGF的表達(dá)水平 取培養(yǎng)后的培養(yǎng)基，經(jīng)過BCA蛋白定量后，參照ELISA試劑盒說明進(jìn)行VEGF的測定。

2.6Western blot法檢測VEGFR2、Notch1和Dll4的表達(dá)水平 收集細(xì)胞后棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗2～3次后加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解0.5 h，提取總蛋白，經(jīng)過BCA蛋白定量后，調(diào)整各組蛋白濃度后經(jīng)過SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、孵育、顯色后在Quantity One軟件下進(jìn)行灰度統(tǒng)計。

2.7qPCR檢測VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表達(dá)水平 按照TRIzol試劑盒操作，提取細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度法檢測總濃度，定量后按照試劑盒方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cRNA在-20 ℃保存，最后利用qPCR檢測各個mRNA的表達(dá)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，計算平均Ct值，設(shè)置陰性對照。采用2-ΔΔCt法計算拷貝數(shù)，并且以β-actin為內(nèi)參照。引物序列見表1。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，對組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferoni校正的t檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 qPCR實驗的引物序列Table 1. The primer sequences for qPCR

F: forward; R: reverse.

結(jié) 果

1 缺血缺氧條件下丁苯酞對HUVECs活力的影響

H/I條件會導(dǎo)致HUVECs凋亡，隨著培養(yǎng)時間的延長，HUVECs的活力下降，而丁苯酞干預(yù)后細(xì)胞活力顯著升高，每個時點與H/I組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，但在24 h和48 h時H/I組以及H/I+NBPhigh組和H/I+NBPlow組的細(xì)胞相對活力均低于50%，12 h時3組細(xì)胞活力較好，所有選擇干預(yù)12 h的實驗時間進(jìn)行后續(xù)實驗。細(xì)胞相對活力見圖1。

Figure 1. The changes of the cell viability. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖1細(xì)胞活力的變化

2 缺血缺氧條件下丁苯酞對HUVECs遷移能力的影響

培養(yǎng)12 h，H/I組和control組的遷移能力無顯著差異，而丁苯酞干預(yù)后HUVECs的遷移能力顯著提高，與H/I組和control組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The results of cell migration capacity. A: control group; B: H/I group; C: H/I+NBPlowgroup; D: H/I+NBPhighgroup. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖2細(xì)胞遷移能力的變化

3 缺血缺氧條件下HUVECs體外血管形成能力的比較

培養(yǎng)12 h，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)control組和H/I組細(xì)胞未見血管形成但是有成管趨勢，說明缺血缺氧的培養(yǎng)條件可以促進(jìn)HUVECs形成管腔，但是作用微弱;丁苯酞干預(yù)后，H/I+NBPlow和H/I+NBPhigh的管腔長度、鏡下成環(huán)數(shù)、成環(huán)節(jié)點和鏡下面積均高于control組和H/I組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The results ofinvitroangiogenesis assay. A: control group; B: H/I group; C: H/I+NBPlowgroup; D: H/I+NBPhighgroup. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖3細(xì)胞體外成管能力結(jié)果

4 缺血缺氧條件下HUVECs分泌VEGF水平的比較

H/I條件 VEGF的表達(dá)顯著高于control組(P<0.05)，說明缺血缺氧環(huán)境可以誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生;而丁苯酞干預(yù)后，VEGF的表達(dá)顯著上調(diào)，與control組和H/I組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The expression of VEGF in the HUVECs under the conditions of H/I. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖4缺血缺氧條件下VEGF的表達(dá)水平

5 缺血缺氧條件下丁苯酞對VEGFR2、Notch1及Dll4蛋白表達(dá)的影響

H/I條件下VEGF2和Dll4蛋白的表達(dá)相比對照組顯著增高(P<0.05)，而Notch1蛋白表達(dá)低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，說明缺血缺氧可以誘導(dǎo)該信號通路的激活；而丁苯酞干預(yù)后，VEGFR2、Notch1和Dll4的表達(dá)水平顯著高于模型組和對照組(P<0.05)，見圖5。

6 缺血缺氧條件下丁苯酞對VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4 mRNA表達(dá)水平的影響

H/I條件下模型組的VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)；而丁苯酞干預(yù)后，VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表達(dá)相比模型組和對照組顯著增高(P<0.05)，見圖6。

討 論

丁苯酞是從芹菜中提取的一種有效成分，可以分為左旋體和右旋體，臨床常用消旋體[4]。研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、增加腦缺血區(qū)血流量、改善腦缺血組織的微循環(huán)和全腦缺血后的能量代謝和抑制炎癥反應(yīng)等作用[5]。同時還可以抗驚厥、抗癲癇，涉及腦缺血病理的多個環(huán)節(jié)和靶點[6]。在改善腦微循環(huán)的研究中提出了腦微循環(huán)的障礙可以造成腦血流量降低，繼發(fā)引起能量代謝失調(diào)，導(dǎo)致腦組織壞死、神經(jīng)功能缺損及炎癥反應(yīng)發(fā)生。研究還表明，丁苯酞預(yù)防及治療性的給藥可以增加MCAO后腦微動脈管徑和血流速度，改善軟腦膜的微循環(huán)[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞可以促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，起到改善微循環(huán)的作用，減少梗死后出血現(xiàn)象。

Figure 5. The effect of NBP on VEGF2-Notch1/Dll4 signal expression under H/I conditions. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖5丁苯酞促進(jìn)缺血缺氧下VEGF2-Notch1/Dll4信號的表達(dá)

Figure 6. The mRNA expression of VEGF, VEGFR2, Notch1 and Dll4 in the HUVECs with different treatments. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/I group.

圖6丁苯酞促進(jìn)缺血缺氧下VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表達(dá)

側(cè)支循環(huán)的開放有賴于側(cè)支血管的形成與開通，而血管形成是一個及其復(fù)雜的過程，VEGF是目前公認(rèn)的在血管再生過程全程發(fā)揮作用的一種生長因子，最早在1983年被提出，總共由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成[8]，VEGF主要是通過激動VEGF受體而發(fā)揮作用的。VEGFR有3種亞型，分別是VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3，它們均屬于酪氨酸激酶受體家族，在細(xì)胞膜外大約有750個氨基酸殘基[9]。在血管新生的過程中，VEGF與VEGFR2結(jié)合后激活下游信號，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的整合素與配體分離，在局部血管基底膜分解后，內(nèi)皮細(xì)胞在局部可以增殖并向外遷移[10]，此時VEGF可以介導(dǎo)Notch1/Dll4信號促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化為頂端細(xì)胞逐漸形成血管芽[11-12]，頂端細(xì)胞在VEGF的作用下產(chǎn)生偽足結(jié)構(gòu)，有利于遷移，黏附及微血管網(wǎng)絡(luò)的生成?？梢哉fVEGF/VEGFR2-Notch1在血管的新生中扮演著十分重要的角色。一般的血管新生需要通過此通路。

本研究著重研究丁苯酞對于VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信號激活與血管新生的作用。缺血性腦卒中中由于缺血缺氧的發(fā)生會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，造成不可逆的損傷，所以臨床治療中常常在短時間中開通閉塞血管，挽救神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。本研究中發(fā)現(xiàn)，模擬缺血缺氧的條件下，丁苯酞可以促進(jìn)HUVECs存活。雖然缺血缺氧條件可以促進(jìn)HUVECs體外形成血管但是此種趨勢不明顯，而丁苯酞可以在此環(huán)境中顯著促進(jìn)HUVECs體外成管，從血管形成中管腔長度、節(jié)點、管腔面積等均顯著優(yōu)于對照組和H/I組，由于VEGF是VEGFR2受體激活的關(guān)鍵信號因子，是促進(jìn)血管形成的起始關(guān)鍵細(xì)胞因子，從實驗結(jié)果來看，丁苯酞在缺血缺氧環(huán)境中誘導(dǎo)VEGF的分泌，激活下游的VEGFR2受體，啟動血管生成的信號通路，同時VEGF還可以誘導(dǎo)Notch/Dll4信號的激活，由于Notch/Dll4信號與HUVECs的遷移和血管芽形成相關(guān)，這與細(xì)胞遷移實驗結(jié)果相一致。缺血性腦卒中的預(yù)后與側(cè)支循環(huán)的開放是密切相關(guān)的，而側(cè)支循環(huán)的開放依賴于微血管的形成和延伸，一般微血管的形成主要經(jīng)過血管內(nèi)皮細(xì)胞的募集、管腔的形成以及基底細(xì)胞的連接而成，在這整個過程中都需要VEGF的參與，而本研究也發(fā)現(xiàn)，體外管腔形成過程中，丁苯酞可以提高VEGF表達(dá)來同時激活VEGFR2和Notch信號，這樣的作用無疑是血管形成的關(guān)鍵，過往研究發(fā)現(xiàn)[13]，胚胎發(fā)育中VEGF的缺失可以造成血管形成障礙，使用Notch信號激活劑可以部分恢復(fù)動脈內(nèi)皮的細(xì)胞標(biāo)記，這提示Notch是VEGF的下游信號，也和本文的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧條件下，丁苯酞可以通過激活VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信號促進(jìn)HUVECs的體外成管能力，這為丁苯酞的臨床應(yīng)用提供了支持，也揭示了丁苯酞治療缺血性腦卒中的機(jī)制。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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