王玉林，呂林林，王 霞，高永清，周 兆，劉革修△，王林靜△

(1廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院， 廣東 廣州 510006； 2暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所， 廣東 廣州 510632)

心腦血管疾病是我國發(fā)病率與致殘率較高的疾病之一，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。心腦血管疾病的發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜，其可能受到同型半胱氨酸[1]、炎癥[2]、高血脂、高血糖[3]和高血壓等不良刺激的影響，致機(jī)體氧化與抗氧化失衡，從而不同程度地?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)生多種心腦血管疾病和嚴(yán)重的并發(fā)癥。在正常生理?xiàng)l件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅維持血管的完整性還具有內(nèi)分泌功能，分泌內(nèi)皮素和一氧化氮(nitric oxide,NO)等血管活性物質(zhì)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管的舒縮功能，與機(jī)體的生理活動(dòng)相協(xié)調(diào)。因此，保護(hù)和預(yù)防血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在心腦血管疾病的防治中起著重要性的作用。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是從枸杞子中提取的一種多聚糖與多肽和蛋白質(zhì)結(jié)合的可溶性復(fù)合物, 主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖 6 種單糖組成，有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和增強(qiáng)免疫功能等多種廣泛重要的生物活性作用[4]，比如其能減輕過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的損傷[5]。但枸杞多糖防治血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究將探討LBP對(duì)過氧化氫損傷的EA.hy926細(xì)胞活力、遷移和凋亡等生物學(xué)特性的影響以及參與調(diào)控的潛在信號(hào)通路，為開發(fā)LBP及其類似物治療和治療心腦血管損傷性疾病提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人內(nèi)皮樣細(xì)胞EA.hy926購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；枸杞多糖由暨南大學(xué)藥學(xué)院葉文才教授課組提供；30% H2O2購自廣州化學(xué)試劑廠；高糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone)； CCK-8試劑(日本同仁公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和0.25%胰酶(Sigma-Aldrich)；吖啶橙(acridine orange，AO)和溴乙啶(ethidium bromide，EB)購自MYM Technologies Limited；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) ELISA試劑盒和NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinsitol 3-kinase，PI3K)抑制劑LY294002(Selleck)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo)；兔抗人cleaved caspase-3單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Akt單克隆抗體、鼠抗人p-Akt單克隆抗體、兔抗人內(nèi)皮型NO合酶(endothelial NO synthase,eNOS)單克隆抗體、兔抗人p-eNOS(Ser1177)單克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體(CST)。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的EA.hy926細(xì)胞復(fù)蘇，轉(zhuǎn)移到25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含1%青鏈霉素和10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組：對(duì)照(control)組，損傷模型(damage)組(50 mmol/L H2O2)、LBP組(100 mg/L LBP)、抗損傷(anti-damage)組[分為3個(gè)亞組，分別用50 mg/L(low dose)、100 mg/L(medium dose)和200 mg/L(high dose)枸杞多糖預(yù)處理1 h后加入50 mmol/L H2O2，之后共處理24 h]和LY294002組(在抗損傷組的基礎(chǔ)上加入PI3K抑制劑LY294002，濃度為20 μmol/L)。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為5×107/L，每孔100 μL細(xì)胞懸液接種到96孔板，在5% CO2、37 ℃和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換成新鮮的含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基后，按分組加入相應(yīng)藥物處理，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集上清液，換上新的培養(yǎng)基并每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，于酶標(biāo)儀450 nm(參比波長(zhǎng)為630 nm)處檢測(cè)各組的吸光度，實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)4次。

2.4劃痕法測(cè)定細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的EA.hy926細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按每孔1×106的密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，使用無菌的200 μL槍頭垂直于6孔板均勻地劃4條互相垂直的橫線，PBS洗去脫落的細(xì)胞，然后加入新鮮含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，并加入LBP使其終濃度為100 mg/L，處理1 h；然后，damage組和anti-damage組分別加入H2O2使其終濃度均為50 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、12 h、24 h和48 h，在帶有拍照系統(tǒng)的倒置顯微鏡(Leica)下觀察拍照，然后使用ImageJ軟件對(duì)各組在不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕寬度進(jìn)行相對(duì)測(cè)量。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按每孔1×106個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預(yù)處理1 h；然后對(duì)damage組和anti-damage組加入H2O2使其終濃度為50 mmol/L，培養(yǎng)24 h后，胰酶消化后，用1 000 r/min離心機(jī)離心5 min收集細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC+PI染色，染色方法參照試劑盒，然后在流式細(xì)胞儀(BD)上檢測(cè)。

2.6AO/EB染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按每孔50 000的密度接種于25T培養(yǎng)瓶中，10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預(yù)處理1 h后加入H2O2使其終濃度為50 mmol/L；在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集所有細(xì)胞(包括細(xì)胞培養(yǎng)液中的)進(jìn)行AO/EB染色，將收集的細(xì)胞用適量的PBS重懸混勻，并吸取50～100 μL的細(xì)胞混懸液于載玻片上進(jìn)行涂片，接著滴加50 μL的AO/EB混合液(濃度均為10 mg/L)并蓋上蓋玻片，然后立即在正立熒光顯微鏡(Leica)下拍照觀察。

2.7Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清NO水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按每孔1×106個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預(yù)處理1 h后加入H2O2使其終濃度為50 mmol/L；培養(yǎng)30 min后收集細(xì)胞上清液，按照試劑盒操作測(cè)定 NO 水平。首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用分光光度計(jì)在 450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各組的吸光度。

2.8ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF的水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按每孔1×106個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預(yù)處理1 h后加入H2O2使其終濃度為50 mmol/L；培養(yǎng)30 min后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒操作測(cè)定VEGF水平。采用分光光度計(jì)在 450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各組的吸光度。

2.9Western blot檢測(cè)蛋白水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，置于10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，加入LBP使其終濃度為100 mg/L，預(yù)處理1 h后加入H2O2使其終濃50 mmol/L；在37 ℃、5% CO2且飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，RIPA法提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量，100 ℃變性5 min后上樣，SDS-PAGE 60 V，30 min后，改為110 V，60 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST漂洗后，5%脫脂奶粉封閉 1 h，孵育 I 抗過夜，TBST漂洗3次，II 抗搖床孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL試劑盒顯色，最后在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光和熒光凝膠成像系統(tǒng)(UVITEC)中顯影拍照觀察，并用Gel-Pro Analyzer 6.0 軟件對(duì)照片進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Graph-Pad Prism 7.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較各組方差齊時(shí)用Student-Newman-Keuls (SNK)檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane’s T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LBP對(duì)H2O2損傷的EA.hy926細(xì)胞活力的影響

與control組相比，damage組EA.hy926細(xì)胞的活力明顯降低(P<0.05)；與damage組比較，LBP預(yù)處理能明顯提高細(xì)胞活力(P<0.05)；LBP的me-dium dose(100 mg/L)組提高細(xì)胞活力最明顯(P<0.05)，但low dose組和high dose組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，故選LBP濃度為100 mg/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

Figure 1. The effects ofLyceumbarbarumpolysaccharides (LBP) on the viability of EA. hy926 cells induced by H2O2. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group;△P<0.05vsmedium dose group.

圖1枸杞多糖對(duì)H2O2損傷的EA.hy926細(xì)胞活力的影響

2 LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡及其形態(tài)學(xué)的影響

2.1LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)100 mg/L的LBP預(yù)處理1 h后，加入H2O2(50 mmol/L)處理24 h，EA.hy926細(xì)胞的凋亡情況所示，與control組相比，damage組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與damage組相比，anti-damage的凋亡率顯著下降(P<0.05)；LBP組的凋亡率與control組的凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2. The effect of LBP on the apoptosis of EA.hy926 cells induced by H2O2. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group.

圖2LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞凋亡的影響

2.2LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 AO能透過所有的細(xì)胞膜，并將其染成綠色，只有細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞可以吸收EB，將核染成紅色。因此，活細(xì)胞擁有正常的綠色；早期凋亡細(xì)胞的核綠色更明顯，并且核內(nèi)染色體出現(xiàn)片段狀；晚期凋亡細(xì)胞出現(xiàn)聚縮的片段化橙色染色體；壞死細(xì)胞則顯示橙色核。經(jīng)H2O2(50 mmol/L)處理24 h后收集細(xì)胞，經(jīng)AO/EB染色，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變；control組的細(xì)胞呈正常的圓形且擁有綠色的細(xì)胞核，而damage組的細(xì)胞呈現(xiàn)大量的紅色細(xì)胞核；anti-damage組的細(xì)胞有少部分細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色；LBP組的細(xì)胞形態(tài)和control組比較無明顯區(qū)別，見圖3。

3 LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO和VEGF水平的影響

與control組相比，damage組的NO濃度顯著降低(P<0.05)；與damage組比較，anti-damage組的NO濃度明顯升高(P<0.05);與anti-damage組比較，LY294002組的NO濃度顯著降低(P<0.05)，提示LBP通過提高NO水平減輕H2O2對(duì)EA.hy926細(xì)胞的損傷作用，見圖4A。與control組比較，damage組的VEGF濃度顯著降低；與damage組比較，anti-damage組的VEGF濃度明顯升高(P<0.05)；與anti-damage組比較，LBP組的VEGF濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4B。

4 LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(0 h、12 h、24 h和48 h)各實(shí)驗(yàn)組的劃痕相對(duì)距離在逐漸減小，見表1。12 h后damage組與control組劃痕間的相對(duì)距離比較明顯增加(P<0.05)。與damage組比較，anti-damage組的劃痕相對(duì)距離明顯縮短(P<0.05)。LBP組與control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示枸杞多糖對(duì)EA.hy926細(xì)胞的遷移有促進(jìn)作用，見圖5及表1。

Figure 3. The influence of LBP on the morphlogical changes of H2O2-induced EA.hy926 cells. The scale bar=100 μm.

圖3LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變

Figure 4. The effects of LBP on the contents of NO (A) and VEGF (B) in H2O2-induced EA.hy926 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group;△P<0.05vsanti-damage group.

圖4LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO和VEGF含量的影響

Figure 5. The effects of LBP on the migration ability of EA.hy926 cells induced by H2O2(×100).

圖5LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞遷移的影響

表1不同時(shí)點(diǎn)LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞相對(duì)遷移距離的影響
Table 1. The migration distances of the EA.hy926 cells pretreated with LBP under H2O2induction at different time points (μm. Mean±SD.n=4)

Group0 h12 h24 h48 hControl574±23316±12136±2653±17Damage571±16447±11?351±45?195±15?Anti-damage562±18383±48?#328±32#105±14?#LBP568±10376±28185±35#△93±24#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group;△P<0.05vsanti-damage group.

5 LBP 對(duì)受H2O2損傷的EA.hy926細(xì)胞p-Akt、cleaved caspase-3、eNOS、p-eNOS、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，damage組的Bcl-2/Bax比值及eNOS和p-eNOS蛋白水平降低,cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；與damage組比較，anti-damage組的Bcl-2/Bax比值升高,cleaved caspase-3蛋白水平降低，eNOS和p-eNOS蛋白水平顯著升高(P<0.05);與anti-damage組比較，LY294002組的p-Akt蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。這一結(jié)果提示LBP對(duì)EA.hy926細(xì)胞的保護(hù)作用與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

Figure 6. The effects of LBP on the protein levels of Bax, Bcl-2, p-Akt, eNOS， p-eNOS and cleaved casepase-3 in the EA.hy926 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdamage group;△P<0.05vsanti-damage group.

圖6EA.hy926細(xì)胞Bax、Bcl-2、eNOS、p-eNOS、p-Akt和cleavedcaspase-3蛋白水平的變化

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要發(fā)病因素，而血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激反應(yīng)則是動(dòng)脈粥樣硬化重要發(fā)病機(jī)制之一[6]。一方面，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基可以增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，有利于脂質(zhì)成分進(jìn)入內(nèi)皮下，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致LDL轉(zhuǎn)變形成ox-LDL、誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生;另一方面，氧化應(yīng)激中的氧自由基不僅刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌促進(jìn)血管收縮的物質(zhì)，影響內(nèi)皮依賴性血管舒張功能缺陷，進(jìn)而加速血管管壁的重構(gòu)，而且過度的氧化應(yīng)激可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBP預(yù)處理減輕H2O2對(duì)EA.hy926細(xì)胞的損傷,提高其細(xì)胞活力，改善其遷移能力，提高了分泌VEGF的水平； LBP通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，增加Bcl-2/Bax比值，降低cleaved caspase-3蛋白水平，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡通常涉及到2種信號(hào)通路，包括線粒體通路和細(xì)胞死亡受體通路。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，線粒體膜電位降低，并釋放大量的氧化應(yīng)激產(chǎn)物。線粒體通路的特征是線粒體釋放細(xì)胞色素C，隨后形成一種細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物，進(jìn)一步激活caspase。細(xì)胞死亡受體通路的特征是細(xì)胞死亡受體與其配體結(jié)合，然后激活caspase-3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-9]。本研究中，H2O2處理后上調(diào)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，LBP預(yù)處理下調(diào)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，表明LBP通過抑制caspase信號(hào)通路的激活，從而抑制了H2O2對(duì)EA.hy926細(xì)胞的損傷。為探究預(yù)處理的藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的變化情況，本實(shí)驗(yàn)采用AO/EB染色在熒光顯微鏡下觀察到，H2O2處理的EA.hy926細(xì)胞的核染色質(zhì)呈明顯的紅色；LBP預(yù)處理的核染色質(zhì)大部分呈現(xiàn)正常的綠色，少部分呈紅色；結(jié)果顯示LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。

研究表明，eNOS對(duì)血管活性具有重要調(diào)節(jié)作用，多種刺激因子通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)其表達(dá)[10-11]。為了進(jìn)一步研究LBP對(duì)H2O2損傷的EA.hy926細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制是否與PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路有關(guān)，本研究中，與damage組比較，LBP預(yù)處理提高細(xì)胞上清液中NO水平和上調(diào)p-Akt、eNOS和p-eNOS蛋白水平。加入PI3K抑制劑后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清液NO水平和p-Akt蛋白水平明顯下降且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明LBP改善血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用消失?？梢缘贸鼋Y(jié)論的是LBP對(duì)H2O2損傷的EA.hy926細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制是激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，LBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制是激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路，上調(diào)p-Akt、eNOS、p-eNOS和Bcl-2的蛋白水平，下調(diào)cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平，提高內(nèi)皮細(xì)胞的活力及NO和VEGF水平。本研究為體外實(shí)驗(yàn)，還需要做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究LBP對(duì)H2O2損傷的機(jī)體的整體調(diào)節(jié)作用，為其在以后的臨床應(yīng)用中提供更多的價(jià)值。LBP作為中國的一種傳統(tǒng)的中草藥，其對(duì)機(jī)體有較少的副作用，可以有效的預(yù)防和治療心腦血管疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生，在臨床上長(zhǎng)期使用具有潛在的前景。

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