郭鶯 汪文華 劉黎卿 胡敏

（1. 福建省亞熱帶植物研究所 福建省生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén) 361006；2. 華僑大學(xué)化工學(xué)院，廈門(mén) 361021）

甘蔗宿根矮化?。≧atoon stunting disease，RSD）是一種普遍存在于蔗區(qū)的世界性病害［1］，在干旱的情況下感病品種的宿根蔗產(chǎn)量損失可達(dá)50%以上［2］。1944-1945年在澳大利亞昆士蘭的甘蔗品種Q28上首次被發(fā)現(xiàn)［3］。一旦感病，植株表現(xiàn)矮化、分蘗少、蔗莖變細(xì)、節(jié)間變短等，但外表無(wú)明顯的病斑，故常常與干旱、養(yǎng)分不足等造成的生長(zhǎng)不良癥狀相混淆［4］。甘蔗宿根矮化病病原菌（Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）為棒狀桿菌屬［5］，寄生于蔗株的木質(zhì)部導(dǎo)管中，可以侵染甘蔗屬所有已知品種，但不侵染其他植物［6］。Lxx病原細(xì)菌特別細(xì)小，分離、培養(yǎng)和檢測(cè)都極其困難，給研究帶來(lái)了很大的難度。免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic separation，IMS）是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)和分離技術(shù)。它是以抗體包被的磁珠為載體，通過(guò)抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，形成抗原——抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場(chǎng)的作用下發(fā)生了定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的目的。本文以感病的拔地拉為材料，從中分離獲得Lxx病原菌進(jìn)行多克隆抗體制備，并采用免疫磁珠技術(shù)標(biāo)記Lxx抗體對(duì)Lxx菌進(jìn)行富集，這樣為直接從甘蔗汁液中獲得大量純的Lxx菌用于病原菌與寄主互作研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試甘蔗 甘蔗熱帶種拔地拉由廣東省農(nóng)科院甘蔗研究室提供，種植于福建省亞熱帶植物研究所隔離溫室內(nèi)，待甘蔗成熟期取蔗莖基部為供試材料用于病原菌的分離。

1.1.2 試劑 MSC培養(yǎng)基購(gòu)于西格瑪試劑公司，BSA、弗氏佐劑購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，PCR反應(yīng)試劑、聚合酶、凝膠純化試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司，pMD-18T載體購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司，F(xiàn)eS04·7H20、FeCl3·6H20、戊二醛、硅烷化試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Lxx抗原制備 切取甘蔗莖基部，進(jìn)行表面清洗滅菌，放入超凈臺(tái)中晾干。將蔗莖切成適合大小用鑷子擠汁，4 000 r/min，離心10 min后收集蔗汁，用普通濾紙進(jìn)行初步過(guò)濾后再用0.45 μm細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將過(guò)濾后的蔗汁100 μL涂布于含有10 μg/mL萘啶酸（Nalidixic acid）的新鮮MSC培養(yǎng)基［7］，于28℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，40 d后觀察并挑取菌落，進(jìn)行電鏡觀察和PCR驗(yàn)證。PCR引物用Pan等［8］報(bào)道的Lxx 16S-23S r DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）特異引物 Lxx1 ：5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′、Lxx2 ：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′， 產(chǎn) 物439 bp。PCR 反應(yīng)體系 ：rTaq 0.25 μL，dNTP 1 μL，10×PCR buffer（Mg2+）2 μL，正向引物 Lxx1 1 μL，反 向 引 物 Lxx2 1 μL，ddH2O 13.75 μL。PCR 擴(kuò) 增程序?yàn)?95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR回收產(chǎn)物送Invitrogen公司測(cè)序，獲得的序列在NCBI網(wǎng)站比對(duì)以確定分離的抗原是否為L(zhǎng)xx。

1.2.2 Lxx抗體制備 選取已鑒定的菌株，加入0.4%的甲醛滅活，加入弗氏佐劑，直接注射兔子，兩周注射一次，共免疫4次，二個(gè)月后抽取血清采用Protein A-Sepharose 4B 作親和層析介質(zhì)純化得到抗體蛋白，利用間接Elisa方法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，計(jì)算P/N=樣品OD值/對(duì)照OD值。若P/N≥2.1，即為陽(yáng)性。

1.2.3 免疫磁珠的制備 根據(jù)劉偉偉報(bào)道的方法［9］，利用化學(xué)共沉淀法合成硅烷化磁性Fe3O4納米粒子，，并取10 mL于干燥的表面皿中烘干至恒重，計(jì)算固形物的含量，其平均粒徑、粒徑分布和表面形貌采用透射電鏡（TEM）進(jìn)行表征；以戊二醛為交聯(lián)劑將硅烷化的磁性Fe3O4納米粒子與Lxx多克隆抗體偶聯(lián)制備免疫磁珠，取10 mg 硅烷化的Fe3O4納米粒子溶于10 mL 0.01 mol/L PH 7.4 PBS，加入 2.5 mL 25%戊二醛，于室溫下攪拌反應(yīng) 6 h。PBS 洗滌3次后用磁石收集，定容至 10 mL，加入 5 μmol抗體于37℃下攪拌 3 h，PBS洗滌3次后用磁石收集于4℃保存。

1.2.4 免疫磁珠對(duì)Lxx親合性檢測(cè) 挑取Lxx單菌落接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，48 h后4000 rmp離心棄上清，用1 mL PBS重懸浮，加入40 μL抗Lxx免疫磁珠混均，37℃孵育1h，低速離心后棄上清，用PBS緩沖液清洗2次，將分離出來(lái)的捕獲有Lxx的免疫磁珠進(jìn)行透射電鏡觀察，并利用Lxx16S引物和特異性引物進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 Lxx培養(yǎng)與鑒定

28℃培養(yǎng)40 d后，培養(yǎng)皿上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的無(wú)色、點(diǎn)狀大小的菌落，中間突起，邊緣整齊，直徑約為0.2 mm（圖1）。挑取菌落在電鏡下觀察，此菌為桿狀細(xì)菌，表面光滑，無(wú)鞭毛，大小為（0.25-0.5）μm×（1-10）μm，菌體為細(xì)長(zhǎng)形，呈直線或微彎的狀態(tài)，有部分一端膨大，有的菌體中間有隔膜存在（圖2）。隨機(jī)挑取培養(yǎng)皿上6個(gè)菌落進(jìn)行 PCR檢測(cè)，待測(cè)菌落均能擴(kuò)增出與正對(duì)照一致的目的條帶（圖3），對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)測(cè)序獲得目的片段大小為438 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)澳大利亞分離的RSD致病菌基因組相應(yīng)區(qū)段序列同源性為100%，進(jìn)化樹(shù)分析顯示其與Leifsonia xyli subsp. Xyli str. CTCB07（AE016822）關(guān)系最近，表明所分離到的即為甘蔗RSD病原菌Lxx。

圖1 病原菌Lxx純培養(yǎng)

圖2 透射電鏡下Lxx病原菌的形態(tài)觀察

圖3 菌落PCR鑒定

2.2 Lxx多克隆抗體的效價(jià)分析

利用分離的RSD病原菌Lxx免疫兔子獲得了較好的多克隆抗體（表1）?？贵w稀釋到204 800倍時(shí)還有明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，而陰性值無(wú)明顯階梯，結(jié)果表明免疫獲得的Lxx抗血清效價(jià)達(dá)大于204 800。

2.3 免疫磁珠合成與檢測(cè)

取10 mL合成的磁性Fe304懸浮液于干燥的表面皿中烘干至恒重，烘干后的質(zhì)量為0.095 g，磁珠的濃度為9.5 mg/mL。通過(guò)TEM觀察Fe304磁性粒子，結(jié)果表明納米級(jí)Fe304磁性微粒的平均粒徑在125-268 nm之間（圖4-A），球體表面均勻，有較好的形貌，分散性良好。免疫磁珠電鏡觀察結(jié)果與磁性Fe304粒子一致，無(wú)雜質(zhì)粘連，也無(wú)貼壁現(xiàn)象（圖4-B）。硅烷化后的磁性Fe304粒子與Lxx抗體偶聯(lián)，從透射電鏡圖片中看其形貌未有變化。

2.4 免疫磁珠對(duì)Lxx的親合性分析

從圖5透射電鏡照片中可以看出，免疫磁珠吸附在Lxx菌體表面，菌越密集，相應(yīng)的吸附在菌體表面的免疫磁珠也越多；低速離心后對(duì)沉淀進(jìn)行的Lxx 特異性PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖6）表明利用免疫磁珠技術(shù)獲得的Lxx分離物可用于進(jìn)一步的PCR研究。

3 討論

RSD已在各甘蔗種植國(guó)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重，是導(dǎo)致甘蔗減產(chǎn)、宿根年限縮短及嚴(yán)重威脅蔗糖產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展的一種重要病害，起初看似是一個(gè)在單一區(qū)域、單一品種上的困擾變成了一個(gè)世界范圍甘蔗產(chǎn)業(yè)的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，且已經(jīng)影響了甘蔗產(chǎn)業(yè)至少70年。RSD的致病菌的體外培養(yǎng)非常困難，盡管在1944年就發(fā)現(xiàn)，但是一直到1980年Davis［3］才成功分離培養(yǎng)。我國(guó)有關(guān)RSD病原菌分離培養(yǎng)的報(bào)道較少，2008年陳健文等［10］利用改良的SC培養(yǎng)基，從甘蔗蔗汁中分離培養(yǎng)到一種桿狀細(xì)菌，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，并結(jié)合血清學(xué)和PCR檢測(cè)方法，確認(rèn)所分離到的菌是甘蔗宿根矮化病的致病菌Lxx；2015年張小秋等［11］利用改良的MSC培養(yǎng)基成功分離Lxx，同年王麗［7］也成功分離了RSD病原菌；但目前仍然還有很多實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有辦法重復(fù)分離 Lxx，主要原因是該菌生長(zhǎng)特別緩慢，往往需要4周左右的時(shí)間才能在培養(yǎng)皿上觀察到菌落，由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，一旦有雜菌產(chǎn)生，分離就失敗，所以控制污染是Lxx菌分離培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有操作均在無(wú)菌超凈臺(tái)中進(jìn)行，分離過(guò)程中使用的工具和試劑均高壓滅菌處理，同時(shí)MSC培養(yǎng)基中還添加殺菌劑萘啶酸，抑制了部分雜菌的生成，一定程度上提高了Lxx分離培養(yǎng)的成功率，但相對(duì)于其它細(xì)菌的培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，這種分離培養(yǎng)的可重復(fù)性較差。免疫磁珠是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)，它將固化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)與免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性結(jié)合于一體，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，滲透到病理、生理、藥理、微生物、生化以及分子遺傳學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，其在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離、生物大分子純化等方面得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，在細(xì)菌分離上也有很大的應(yīng)用前景［12-14］。在細(xì)菌分離上，與傳統(tǒng)的方法相比，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。張蓉蓉等［15］利用免疫磁珠技術(shù)分離豬胸膜肺炎放線桿菌，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高此病原菌的分離效率；丁浩［16］在利用免疫磁珠富集法對(duì)牛源大腸桿菌O157：H7分離鑒定的研究中發(fā)現(xiàn)免疫磁珠吸附技術(shù)和普通方法相比雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著，但確實(shí)能夠增加大腸桿菌 O157：H7的分離數(shù)量；Islam等［17］利用免疫磁珠分離技術(shù)與PCR法相結(jié)合檢測(cè)志賀菌，比傳統(tǒng)的培養(yǎng)法快7 h。本研究中，利用項(xiàng)目研發(fā)的Lxx多克隆抗體制備的免疫磁珠對(duì)Lxx親合性強(qiáng)，透射電鏡觀察免疫磁珠吸附Lxx菌體的表面，并在重力作用下免疫磁珠-Lxx混合物從培養(yǎng)基中分離出來(lái)可進(jìn)一步用于PCR檢測(cè)，這為為直接從甘蔗汁液中獲得大量純的Lxx用于轉(zhuǎn)錄組或與寄主的互作研究提供了可能；利用免疫磁珠技術(shù)從甘蔗汁液中分離獲得Lxx用于病原菌的培養(yǎng)是否可以減少菌培養(yǎng)過(guò)程中的污染，提高培養(yǎng)成功率還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)。另外，項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該菌存在退化現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基PH值和培養(yǎng)溫度都不能改善其退化現(xiàn)象，推測(cè)目前的分離培養(yǎng)基還不是最適的配方，今后應(yīng)對(duì)Lxx的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。

表1 Lxx多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定結(jié)果

圖4 納米級(jí)Fe304磁性微粒和免疫磁珠的透射電鏡圖片

圖5 透射電鏡下免疫磁珠對(duì)Lxx的親合性分析

圖6 免疫磁珠與Lxx菌液免疫反應(yīng)的分離物PCR檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

通過(guò)從感病蔗汁中分離培養(yǎng)的RSD致病菌，免疫獲得了效價(jià)較高的Lxx多克隆抗體，制備的免疫磁珠對(duì)Lxx親和性強(qiáng)，能夠快速實(shí)現(xiàn)Lxx的分離，實(shí)驗(yàn)證明可進(jìn)一步用于PCR檢測(cè)，為L(zhǎng)xx與甘蔗互作時(shí)期下甘蔗感病性檢測(cè)和病原菌的富集提供了便捷高效的技術(shù)手段。

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