浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 杭州 310005

一過(guò)性食管下括約肌松弛(transient lower esophageal sphincter relaxation,TLESR)是指非吞咽情況下食管下括約肌（low esophageal sphincter,LES）發(fā)生自發(fā)性松弛，被認(rèn)為是胃食管反流病的主要病因[1-2]。而胃擴(kuò)張是引起TLESR的主要誘因之一[3-4]，胃壁拉伸可通過(guò)迷走-迷走反射（vago-vagal reflex）誘發(fā)TLESR。孤束核是腦干內(nèi)接受內(nèi)臟初級(jí)感覺(jué)傳人信息的重要核團(tuán)，對(duì)迷走-迷走反射具有重要的調(diào)控作用[5]。來(lái)自胃賁門部的感覺(jué)信號(hào)通過(guò)迷走神經(jīng)感覺(jué)傳入纖維投射到腦，其突觸末端終止于孤束核[6]，因此孤束核在TLESR的發(fā)生機(jī)制中扮演著重要的角色。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“足三里”是足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴，又為下合穴，善治胃腑病證。針刺“足三里”穴對(duì)包括食管在內(nèi)的整個(gè)消化系運(yùn)動(dòng)功能具有良性調(diào)節(jié)作用[7]，其傳出途徑是迷走神經(jīng)。腦干孤束核作為迷走神經(jīng)中樞接受沖動(dòng)，進(jìn)行綜合性調(diào)節(jié)活動(dòng)[8]。γ-氨基丁酸受體(γ-aminobutyric acid receptor,GABA-R)廣泛存在于中樞孤束核神經(jīng)細(xì)胞中，與其電活動(dòng)有著密切關(guān)系。筆者推測(cè)孤束核在參與電針對(duì) TLESR的干預(yù)中發(fā)揮了重要的作用，而GABAB受體的調(diào)控作用可能是其主要機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物隨機(jī)分模型組（胃擴(kuò)張誘發(fā)造模 6只）、足三里組（造模+電針“足三里”6只）、非經(jīng)非穴組（造模+無(wú)效電針6只）、沙克洛芬（Saclofen來(lái)源abcam）組（造模+電針“足三里”+GABAB受體阻斷劑6只）和空白注射組（造模+電針“足三里”+無(wú)效注射 6只）。

1.2 胃擴(kuò)張誘發(fā)TLESR模型 參考相關(guān)文獻(xiàn)，大鼠禁食10h后，10%水合氯醛(0.35ml/100g體重)腹腔注射麻醉下，輕柔地插一端套有薄膜囊的聚乙烯軟管入胃，深度為下食管括約肌下4cm，向氣囊內(nèi)注水，給予胃內(nèi)壓≥5.32 kPa(40mmHg)壓力的時(shí)相性胃擴(kuò)張(注水2min，間歇4min，交替進(jìn)行，6min為1輪，共10 輪[9-10]。

1.3 孤束核內(nèi)微量注射針的埋入 大鼠在10%水合氯醛(0.35ml/100g體重)腹腔注射麻醉下，固定于立體定向儀上，切開(kāi)大鼠頭部皮膚，暴露骨縫，參照LJ.Pellegrine鼠腦定向圖譜，顱骨鉆孔,埋植不銹鋼套管(外徑0.5mm，內(nèi)置直經(jīng)0.3mm的不銹鋼絲，其下端比套管長(zhǎng)0.5mm)，微量注射時(shí)，將不銹鋼絲內(nèi)芯拔出，微量注射針超出外套管1mm，用于局部微量注射。

1.4 測(cè)壓流程 將適度麻醉的大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使用消化道動(dòng)力檢測(cè)系統(tǒng)GAP-08A，經(jīng)口插入測(cè)壓管，使遠(yuǎn)端3個(gè)通道均置于胃內(nèi),開(kāi)始記錄測(cè)壓數(shù)據(jù)。采用定點(diǎn)牽拉法勻速牽拉（每15s向外牽拉測(cè)壓管10mm)測(cè)壓管直至第2或含第3通道，顯示位于LES內(nèi)時(shí),將測(cè)壓管固定于動(dòng)物口邊。監(jiān)測(cè)TLESR及TLESR伴反流的發(fā)生次數(shù)。足三里組及非經(jīng)非穴組在胃擴(kuò)張的同時(shí)電針雙側(cè)相關(guān)穴位。沙克洛芬（GABAB受體阻斷劑）組和空白注射組，在進(jìn)行電針“足三里”及食管測(cè)壓前30min，微量注射針連接微量注射泵，以1μl/min的速度向孤束核區(qū)注射1μl的沙克洛芬或改良Riger液，注入時(shí)程為1min，滯留1min，然后開(kāi)始測(cè)壓。

1.5 電針穴位和電針參數(shù) 按照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)部提供的大鼠穴位圖譜及比較解剖學(xué)取穴“足三里”，采用華佗牌 0.30mm×25mm 針灸針，刺入雙側(cè)穴位，連接電子針灸治療儀CMNS6-1型，頻率 2/100Hz連續(xù)波，電流1mA，時(shí)間60min。模型組僅給予單純胃擴(kuò)張，不進(jìn)行電針。

1.6 TLESR的判定標(biāo)準(zhǔn) LES從開(kāi)始松弛到完全松弛的時(shí)間≤10s；LES的最低壓力應(yīng)≤2mmHg。此外，對(duì)于壓力≤2mmHg，松弛時(shí)間≥10s的LES松弛，且可以除外是由于多次快速吞咽所致，可以被認(rèn)為是TLESR。

1.7 TLESR伴反流判定標(biāo)準(zhǔn) 至少2個(gè)食管測(cè)壓導(dǎo)聯(lián)中壓力同時(shí)突然持續(xù)增加是氣體或液體從胃中反流到食管中的標(biāo)志。

TLESR伴反流率=每組發(fā)生反流的總次數(shù)/總TLESR次數(shù)。

1.8 免疫組化法檢測(cè)孤束核區(qū)GABAB受體的表達(dá)用10%水合氯醛(0.35ml/100g體重)腹麻醉大鼠,完全麻醉后開(kāi)胸通過(guò)左心室灌注生理鹽水，至右心房流出的液體變清，再用 4%多聚甲醛溶液快速灌注固定，之后繼續(xù)緩慢固定30min，斷頭取延髓界溝的外側(cè)（孤束核），標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛溶液6h，然后于4℃用15%蔗糖溶液脫水24h，標(biāo)本均沉至容器底部，再用30%蔗糖溶液于4℃脫水48h，標(biāo)本全部沉底，取出標(biāo)本，用錫箔紙包裹密封，用液氮迅速冷凍。于恒溫冷凍切片機(jī)內(nèi)連續(xù)冠狀位冰凍片，片厚20μm，用于免疫組化染色，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈黃褐色，在每只大鼠隨機(jī)取10張切片，并在200倍光鏡下隨機(jī)選擇孤束核區(qū)相應(yīng)部位的5個(gè)視野，進(jìn)行GABAB受體陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，TLESR頻率應(yīng)用中位數(shù)表示，其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s）表示。組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 電針及藥物對(duì)TLESR頻率的影響 與模型組［9次/h（范圍：7～11）］相比，足三里組［6次/h（范圍：4～8）］TLESR 頻率較低（P=0.023<0.05，T=3.248），而非經(jīng)非穴組［9次/h（范圍：7～13）］TLESR 頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.837>0.05，T=0.216）；與空白注射組［9次/h（范圍：7～13）］相比，沙克洛芬組［18次/h（范圍：15～21）］TLESR 的頻率顯著升高（P<0.001，T=10.686）。見(jiàn)圖 1。

圖1 各組發(fā)生TLESR頻率（次/小時(shí)）

2.2 電針對(duì)TLESR時(shí)合并反流的影響 與模型組相比，足三里組可以降低合并返流的比例（P<0.05），而非經(jīng)非穴組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白注射組相比，GABAB受體阻斷劑沙克洛芬組的TLESR合并返流比例顯著升高（P<0.001）。見(jiàn)表1。

表1 各組發(fā)生TLESR合并反流率

2.3 孤束核區(qū)GABAB受體表達(dá) 與模型組相比，足三里組孤束核區(qū)的GABAB受體陽(yáng)性面積增加（P<0.05）。與足三里組相比，沙克洛芬組孤束核區(qū)的GABAB受體陽(yáng)性面積減少（P<0.001）。見(jiàn)表2及圖2。

表2 各組大鼠孤束核區(qū)GABAB受體免疫組化陽(yáng)性面積

3 討論

針刺療法由于其安全有效的優(yōu)勢(shì)，在臨床上用于治療胃食管反流病正被越來(lái)越多的患者接受?！白闳铩毖ㄗ鳛樽汴?yáng)明胃經(jīng)的合穴、下合穴，是針灸治療消化系統(tǒng)疾病的常用穴。目前臨床研究提示[11-12]，針刺“足三里”等穴來(lái)治療胃食管反流病，可顯著改善臨床癥狀，降低復(fù)發(fā)率。研究顯示，針刺“足三里”穴對(duì)食管運(yùn)動(dòng)有明顯的雙向調(diào)節(jié)作用，它既可以提高食管動(dòng)力障礙患者的食管運(yùn)動(dòng)功能，也能緩解食管下括約肌興奮性增高患者的食管下括約肌痙攣，使吞咽順暢[13]。Zou等[14]發(fā)現(xiàn)電針可通過(guò)降低TLESR的頻率來(lái)改善反流癥狀。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，電針“足三里”穴可有效降低大鼠胃擴(kuò)張所誘發(fā)的TLESR頻率，而電針?lè)墙?jīng)非穴則沒(méi)有上述效果，說(shuō)明電針“足三里”對(duì)食管下括約肌運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié)具有一定的經(jīng)絡(luò)和穴位特異性。同時(shí)侯曉華等[15]研究發(fā)現(xiàn)健康人中35%的TLESR伴隨胃食管反流，而胃食管反流病患者則有65%TLESR伴隨反流，所以如何防止過(guò)多的胃內(nèi)容物反流入食管減少其食道黏膜損傷亦十分重要。在本動(dòng)物試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)電針“足三里”在抑制TLESR的同時(shí)，能夠有效降低其合并反流的發(fā)生，為胃食管反流病的治療提供了理論依據(jù)及新的思路。

圖2 各組大鼠孤束核區(qū)GABAB受體免疫組化染色（200×）

TLESR被認(rèn)為是胃食管反流病的根本病因，其發(fā)生與胃底、咽部的迷走神經(jīng)機(jī)械感受器受到刺激引起的迷走-迷走反射密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)電針大鼠穴位可以誘發(fā)迷走神經(jīng)放電，并且這種作用可以通過(guò)脊髓橫斷來(lái)逆轉(zhuǎn)，提示電針“足三里”對(duì)迷走神經(jīng)的刺激作用有可能是通過(guò)中樞的機(jī)制而完成的[16]。牟向東等[17-18]發(fā)現(xiàn)采用電針刺激“足三里”穴，可使健康大鼠食管下段括約肌壓力明顯升高，在阻斷膽堿能M受體后，電針的干預(yù)效果被明顯減弱，但電針仍可使LESP恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明電針對(duì)食管下括約肌的干預(yù)效應(yīng)除迷走神經(jīng)的膽堿能受體外，還有其他途徑。孤束核是腦干內(nèi)接受內(nèi)臟初級(jí)感覺(jué)傳人信息的重要核團(tuán)，接受由迷走神經(jīng)傳入的胃擴(kuò)張等引發(fā)的感覺(jué)信號(hào)，調(diào)控食管下括約肌，在引發(fā)TLESR的過(guò)程中起重要作用[19]。GABA為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，而孤束核中存在大量的GABAB受體。對(duì)孤束核內(nèi)GABA能神經(jīng)末梢的超微結(jié)構(gòu)研究顯示GABAB受體和外周傳入末梢有緊密的聯(lián)系[18]，調(diào)節(jié)孤束核中GABAB受體可影響迷走神經(jīng)機(jī)械感受器，改變迷走神經(jīng)傳出沖動(dòng)[21]。本研究組猜測(cè)電針“足三里”對(duì)TLESR的抑制作用可能與孤束核中GABAB受體有關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了應(yīng)用微注射GABAB受體阻斷劑沙克洛芬對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理，從而觀察孤束核中GABAB受體對(duì)電針“足三里”穴抑制TLESR作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：阻斷GABAB受體的沙克洛芬可以逆轉(zhuǎn)“足三里”對(duì)TLESR及其合并反流的抑制作用，使TLESR發(fā)生及其合并反流頻率大幅上升，說(shuō)明電針“足三里”穴對(duì)TLESR的作用與GABAB受體狀態(tài)有關(guān)。因此，GABAB受體在經(jīng)迷走神經(jīng)通路調(diào)控TLESR的過(guò)程中扮演著重要的角色。進(jìn)一步的免疫組化結(jié)果顯示，電針“足三里”組與模型組大鼠相比，孤束核中GABAB受體表達(dá)上調(diào)，兩組間差異存在顯著性意義，說(shuō)明電針“足三里”不但可以激動(dòng)GABAB受體，還能夠上調(diào)其表達(dá)水平。但GABAB受體需要與GABA神經(jīng)遞質(zhì)相結(jié)合才能發(fā)揮效應(yīng)，電針“足三里”穴對(duì)孤束核內(nèi)GABA神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，仍需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明電針“足三里”可能通過(guò)激動(dòng)孤束核中GABAB受體，影響迷走神經(jīng)-食管中樞調(diào)控機(jī)制來(lái)恢復(fù)LES正常生理功能，減少TLESR發(fā)生及其合并反流頻率。同時(shí)仍需結(jié)合傳統(tǒng)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，通過(guò)進(jìn)一步的研究來(lái)闡明其作用機(jī)制。

[1]林三仁,許國(guó)銘,胡品津,等.中國(guó)胃食管反流病共識(shí)意見(jiàn)[J].胃腸病學(xué),2007,12(4):233-239.

[2]侯淵濤,孫曉紅,李曉青,等.胃食管反流病患者食管動(dòng)力異常及其對(duì)食管酸暴露的影響[J].中華內(nèi)科雜志,2015,54(10):865-869.

[3]楊靜,王馳.電針貓“足三里”穴抑制胃擴(kuò)張所致的一過(guò)性下食管括約肌松弛[J].針刺研究,2011,36(6):423-427.

[4]JBoulant,S Mathieu,M D'Amato,A Abergel,M Dapoigny and G Bommelaer.Cholecystokinin in transient lower oesophageal sphincter relaxation due to gastric distension in humans.Gut,1997,40(5):575-581.

[5]房軍帆,杜俊英,邵曉梅,等.電針“足三里”穴干預(yù)孤束核神經(jīng)元興奮性的樣本熵和頻率分析[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)報(bào),2016,40(12):865-869.

[6]向娟,陳果,李飛,等.針灸治療胃黏膜損傷中樞調(diào)控機(jī)制的研究[J].上海針灸雜志,2016,35(12):1484-1487.

[7]Tatewaki M,Harris M,Uemura K,Ueno T,et al.Dual effects of acupuncture on gastricmotility in conscious rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2003,285(4):R862-872.

[8]王述菊,孫國(guó)杰,杜艷軍,等.孤束核在針刺“足三里”調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)中的作用機(jī)制[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(9):28-30.

[9]Chi Wang,De-Feng Zhou,Xiao-Wei Shuai,et al.Effects and mechanisms of electroacupuncture at PC6 on frequency of transient lower esophageal sphincter relaxation in cats[J].World Journal of Gastroenterology(English Edition),2007(36)13:4873-4880.

[10]彭艷,易受鄉(xiāng),李振海，等.毫針不同刺激強(qiáng)度對(duì)胃擴(kuò)張?zhí)弁创笫蠹顾璞辰荖MDA受體和P物質(zhì)的影響[J].世界華人消化雜志,2009,17(13):1339-1345.

[11]葛力軍,賈如，李季委.針灸治療肝胃不和型胃食管反流病21例[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2009,16(2):137.

[12]梁波,賀劍波，劉漢平.針刺中脘不同組穴治療胃食管反流病的臨床觀察[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010,28(3):564-566

[13]張曉艷,謝鵬雁.足三里穴與食管運(yùn)動(dòng)功能的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2009,17(11):1108-1111.

[14]Zou D,Chen WH,Iwakiri K,et al.Inhibition of transient lower esophageal sphincter relaxations by electrical acupoint stimulation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2005,289(2):197-201.

[15]查慧,謝小平,侯曉華.胃食管返流病患者酸反流與食管運(yùn)動(dòng)功能障礙的關(guān)系[J].胃腸病學(xué),2006,11(1):41-44.

[16]Li Y Q,Zhu B,Rong P J,et al.Neural mechanism of acupuncture-modulated gastric motility[J].World Journal of Gastroenterology,2007,13(5):709-716.

[17]牟向東,謝鵬雁,劉建湘,等.電針刺大鼠足三里穴對(duì)LESP血漿胃泌素和胃動(dòng)素的影響[J].世界華人消化雜志,2005,13(9):1069-1073.

[18]牟向東,謝鵬雁,王化虹,等.電針大鼠足三里調(diào)節(jié)下食管括約肌壓力神經(jīng)通路的探討[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2008,15（5）:31-32.

[19]Kuo P,Bravi I,Marreddy U,et al.Postprandial cardiac vagal tone and transient lower esophageal sphincter relaxation(TLESR)[J].Neurogastroenterology&Motility the Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society,2013,25(10):841-e639.

[20]Fawley J A,Peters J H,Andresen M C.GABA(B)-mediated inhibition of multiple modes of glutamate release in the nucleus of the solitary tract[J].Journal of Neurophysiology,2011,106(4):1833.

[21]Boeckxstaens G E,Beaumont H,Mertens V.Effects of lesogaberan,a novel GABA(B)-receptor agonist,on reflux and lower esophageal sphincter function in patients with gastroesophageal reflux disease[J].Gastroenterology,2010,139:377-379.