李紅兵 譚子虎

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 武漢 430061 2.貴陽市第一人民醫(yī)院 3.湖北省中醫(yī)院

目前我國血管性癡呆（vascular dementia，VD）發(fā)病率僅次于阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），VD患者約占癡呆患者總數(shù)的20%[1]。近年來，中醫(yī)藥治療VD取得了較好效果?；凇督饏T要略》薯蕷丸原方化裁而來的加減薯蕷丸（Modified Dioscorea Pills，MDP）具有補(bǔ)腎填精、益氣通絡(luò)、健脾調(diào)肝之功，臨床上對于非癡呆型血管性認(rèn)知功能障礙及中風(fēng)后失語等疾病療效顯著[2-3]。眾所周知，突觸是神經(jīng)信息傳遞與處理過程的中心環(huán)節(jié)，因此突觸的數(shù)量及功能狀態(tài)對認(rèn)知功能具有決定性作用。筆者所在團(tuán)隊(duì)的前期研究證實(shí)，MDP可明顯促進(jìn)VD大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的mRNA表達(dá)[4]，而BDNF可促進(jìn)突觸再生，提高突觸可塑性，從而改善VD大鼠智能[5]。為進(jìn)一步明確MDP對VD大鼠海馬區(qū)突觸的影響，本研究從突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)和突觸的超微結(jié)構(gòu)的角度進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠40只，8～9周齡，體質(zhì)量約（300±20）g，購自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018]。大鼠喂養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動物房，進(jìn)食及飲水自由，飼料由湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。光照/黑暗時間 12/12h，溫度（22±2）℃，濕度（60±10）%。

1.2 主要試劑和儀器 MDP由山藥、熟地黃、何首烏、全當(dāng)歸、杜仲、川芎、西黨參、茯苓、白術(shù)、白芍、枸杞、菖蒲、遠(yuǎn)志、五味子共14味中藥組成，均由湖北省中醫(yī)院制劑室提供，經(jīng)提純濃縮制備成含藥材1g·mL-1的濃縮湯劑。小鼠抗大鼠微管相關(guān)蛋白-2（microtubule associated protein-2，MAP-2）抗體（anti-MAP-2）、小鼠抗大鼠突觸素（synaptophysin，SYP）抗體（anti-SYP）及小鼠抗大鼠突觸后密度蛋白-95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）抗體（anti-PSD-95）均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（批號分別為：17490-1-AP、17785-1-AP、20665-1-AP)。水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備及軟件購于成都泰盟科技公司。Hitachi H-7000FA型透射電鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組及造模方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為手術(shù)組28只及假手術(shù)組12只。手術(shù)組采用改良雙血管阻斷（2-vessels occlusion，2-VO）法建立大鼠VD模型，具體方法為：大鼠采用異氟烷吸入麻醉后先分離右側(cè)頸總動脈并兩端結(jié)扎，從結(jié)扎中心剪斷頸總動脈，分層縫合并以青霉素40萬U/只局部注射預(yù)防感染，1周后以同樣方法處理左側(cè)頸總動脈。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎及剪斷頸總動脈，其余操作步驟同手術(shù)組。VD模型造模成功判定：大鼠清醒后反應(yīng)遲鈍，行動遲緩，行走不穩(wěn)，呈現(xiàn)無目的的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動。2-VO術(shù)后1周后進(jìn)行1次Morris水迷宮定位航行訓(xùn)練，以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，逃避潛伏期超過參考值20%的大鼠定義為癡呆大鼠。

1.4 干預(yù)措施 術(shù)后假手術(shù)組大鼠死亡1只，手術(shù)組死亡5只，存活大鼠均造模成功。將手術(shù)組存活大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為藥物組12只，模型組11只。2-VO術(shù)后1周，藥物組以MDP濃縮湯劑灌胃，按黃繼漢等[6]的方法，藥物劑量換算系數(shù)為0.162，藥物組大鼠灌胃1mL/100g，1次/d，即相當(dāng)于成人劑量1.62g/kg·d，共灌胃45d；模型組及假手術(shù)組大鼠采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，劑量、療程及方法同藥物組。

1.5 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠行為學(xué)改變 常規(guī)進(jìn)行定位航行及空間搜索實(shí)驗(yàn)[7]，共進(jìn)行5d，前4d為定位航行實(shí)驗(yàn)，最后1d為空間搜索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)每天進(jìn)行2次，從四個不同象限中將大鼠面向池壁放入水中，計(jì)算機(jī)自動計(jì)算每個大鼠的航行距離及逃避潛伏期。如果大鼠在120s內(nèi)找不到水下的平臺，則引導(dǎo)其到平臺并停留2min，使其記憶平臺與周圍環(huán)境的關(guān)系，逃避潛伏期記為120s。其余則按照實(shí)際時間和距離由計(jì)算機(jī)測算。最后1d則撤除平臺，計(jì)算大鼠在120s搜索過程中，跨越平臺次數(shù)、平臺所在象限（第一象限）游行時間、游行距離以及總游行距離。

1.6 免疫組化檢測突觸相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組選擇8只大鼠，10%水合氯醛（0.35g·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于解剖板上，剖開腹腔，暴露肝臟和橫膈膜，迅速剪開橫膈膜，打開胸腔，暴露心臟。將灌注針頭從心尖部位經(jīng)左心室插入升主動脈，剪開右心耳，快速灌入0.9%氯化鈉溶液100～150mL，直至體循環(huán)血液沖洗干凈，灌流液轉(zhuǎn)為清亮。待大鼠尾巴伸直，四肢顫抖停止，觀察肝臟逐漸變成白色，再用4%多聚甲醛250mL灌注。40min后斷頭取腦組織，4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定12～24h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制備海馬石蠟切片，經(jīng)過抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后分別添加一抗（anti-MAP-2、anti-SYP及anti-PSD-95），再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB顯色及Harris蘇木素復(fù)染。采集圖像，每張切片選取3張400倍照片，使用IPP6.0軟件進(jìn)行光密度分析，以平均光密度表示各蛋白表達(dá)水平。

1.7 突觸超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察 每組選擇3只大鼠，10%水合氯醛（0.35g·kg-1）腹腔注射麻醉后，斷頭處死，立即快速剝離腦組織，沿視交叉前端作冠狀切面，取大鼠左側(cè)大腦海馬CA1區(qū)組織3塊，組織塊約1mm3大小，經(jīng)固定、漂洗、脫水、滲透、包埋后以超薄切片機(jī)制作60～80nm切片。鈾鉛雙染色，干燥過夜后透射電鏡下觀察突觸情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)改變比較 水迷宮實(shí)驗(yàn)最初2d，各組大鼠逃避潛伏期及逃避距離沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。第3天開始，假手術(shù)組大鼠逃避距離及逃避潛伏期與模型組相比下降較多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。第4天藥物組大鼠逃避距離及逃避潛伏期下降較快，與假手術(shù)組接近，二者與模型組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.05）。見表 1、2。在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組及藥物組大鼠跨越平臺次數(shù)均多于模型組（P＜0.01，P＜0.05），平臺所在象限游行時間及游行距離也多于模型組（P＜0.05，P＜0.01），但 3組大鼠的總游行距離及速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

表1 各組大鼠逃避距離比較（±s,cm）Tab.1 Comparison of escaping latency among different groups(±s,cm)

表1 各組大鼠逃避距離比較（±s,cm）Tab.1 Comparison of escaping latency among different groups(±s,cm)

注：與模型組相同時點(diǎn)比較，*P＜0.05。Note:Compared with model group at the same time,*P＜0.05.

表2 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s,s）Tab.2 Comparison of escaping latency among different groups(±s,s)

表2 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s,s）Tab.2 Comparison of escaping latency among different groups(±s,s)

注：與模型組相同時點(diǎn)比較，*P＜0.05。Note:Compared with model group at the same time,*P＜0.05.

表3 各組大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）Tab.3 Comparison of the parameters of probing test among different groups(±s)

表3 各組大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）Tab.3 Comparison of the parameters of probing test among different groups(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2 各組大鼠海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)比較 藥物組及假手術(shù)組大鼠MAP-2蛋白表達(dá)高于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05），而且藥物組高于假手術(shù)組（P＜0.01）。藥物組大鼠SYP蛋白表達(dá)明顯高于模型組及假手術(shù)組（P＜0.01，P＜0.01），而且藥物組明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。藥物組及假手術(shù)組大鼠PSD-95 蛋白表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.01，P＜0.01），而且藥物組高于假手術(shù)組（P＜0.01）。見圖1、表4。

2.3 各組大鼠突觸的超微病理學(xué)分析 從電鏡圖像可以看出，假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)完整，突觸間隙清晰可見，突觸前后膜間吻合良好，突觸后膜可見均勻增厚，突觸曲面弧度規(guī)整，突觸小泡豐富，線粒體結(jié)構(gòu)完整；模型組突觸間隙消失，突觸前后膜界限模糊，弧度不規(guī)則，突觸小泡較少，線粒體嵴腫脹甚至消失；藥物組突觸結(jié)構(gòu)疾病正常，突觸間隙清晰可見，突觸后膜均勻增厚，突觸小泡較多，線粒體結(jié)構(gòu)完整、豐富。見圖2。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)MAP-2、SYP、PSD-95的表達(dá)（400×）Fig.1 Expression of MAP-2,SYP,PSD-95 in hippocampus among different groups(400×)

表4 各組大鼠海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of expression of synaptic associated proteins among different group(±s)

表4 各組大鼠海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of expression of synaptic associated proteins among different group(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，##P＜0.01。Note:Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with sham-operated group,##P＜0.01.

3 討論

VD是最常見的認(rèn)知功能障礙病因之一，屬中醫(yī)“文癡”“呆病”“善忘”“郁證”等范疇?！夺t(yī)方集解》言：“人之精與志，皆藏于腎。腎精不足則志氣衰，不能上通于心，故迷惑善忘也?！盵8]因此腎虛，腎中精氣不足可影響到心神而導(dǎo)致癡呆。此外，《靈樞·平人絕谷》言“血脈和利，精神乃居”，進(jìn)一步指出血脈通暢是精神、情智、認(rèn)知正常的必要條件。因此，治療VD多以補(bǔ)腎填精、健脾益氣、疏通經(jīng)絡(luò)等方藥配伍而獲良效。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)透射電鏡圖像Fig.2 The synaptic images of three groups observed with TEM

MDP組方中以山藥為君，重在補(bǔ)腎益氣；以熟地黃、何首烏、全當(dāng)歸為臣，加強(qiáng)補(bǔ)腎填精、活血通絡(luò)、滋陰養(yǎng)血的功效，補(bǔ)而不滯；另以杜仲、川芎為佐，進(jìn)一步加強(qiáng)補(bǔ)腎通絡(luò)功效，再佐以西黨參、茯苓、白術(shù)益氣健脾，意為補(bǔ)后天之本以促先天之本功能健旺；以白芍、枸杞、菖蒲、遠(yuǎn)志、五味子為使調(diào)肝寧神，同時秉承肝腎同源、精血互化理論，從而達(dá)到滋陰潤燥、調(diào)攝精神之功效。諸藥合用，使腎氣健旺、腦絡(luò)通順、五臟得調(diào)，自當(dāng)五神各安其位、五體靈活、五官靈敏而反應(yīng)如常。

大鼠和人類一樣，具有完整的Willis環(huán)，因此本研究采用2-VO法建立大鼠VD模型。雙側(cè)頸總動脈阻斷后可導(dǎo)致大鼠海馬慢性供血不足。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對缺血、缺氧損害極其敏感[7]，頸總動脈阻斷導(dǎo)致的缺血缺氧性病變勢必導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡及突觸的變性和丟失，使突觸數(shù)量下降，可塑性降低，突觸相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變，并進(jìn)一步影響突觸的結(jié)構(gòu)與功能。研究表明，突觸相關(guān)蛋白可調(diào)控突觸的生長、發(fā)育、成熟，并與突觸可塑性密切相關(guān)，當(dāng)其表達(dá)發(fā)生改變后可使個體產(chǎn)生神經(jīng)精神癥狀，出現(xiàn)焦慮、感覺與認(rèn)知功能受損、交流缺陷以及社會活動缺陷等[9]，因此突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)是突觸數(shù)量及功能狀態(tài)的標(biāo)志，能夠從微觀層面反映突觸的病理生理變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，MDP能明顯改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。免疫組化檢測則進(jìn)一步證實(shí)MDP能明顯促進(jìn)突觸相關(guān)蛋白SYP、MAP-2、PSD-95的表達(dá)，藥物組明顯高于模型組及假手術(shù)組。SYP是一種突觸前囊泡特定蛋白，由313個氨基酸組成，分子量38kDa，對突觸形成和突觸功能的維持意義重大，是突觸重建的重要標(biāo)志。SYP可作為突觸結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物，在神經(jīng)外科手術(shù)中常用來標(biāo)記突觸終末，避免神經(jīng)損傷[10]。MAP-2主要表達(dá)在神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘和突觸后致密區(qū)，作為神經(jīng)元樹突生長的標(biāo)志蛋白，與突觸可塑性與樹突棘的形態(tài)與功能密切相關(guān)，在神經(jīng)元突起形成和突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[11]，與癲癇等疾病密切相關(guān)。PSD-95是一種由724個氨基酸構(gòu)成的突觸后蛋白，與突觸的可塑性、學(xué)習(xí)記憶等相關(guān)，其變異可導(dǎo)致個體智能障礙。PSD-95參與了樹突棘的生長、發(fā)育、分支及成熟，在突觸信號修飾方面也發(fā)揮作用[12]。神經(jīng)元PSD-95的表達(dá)增多和突觸興奮性增強(qiáng)相關(guān)[13]，而AD及輕度認(rèn)知障礙（minimal cognitive impairment，MCI）患者的神經(jīng)元PSD-95表達(dá)則明顯下降。

本研究中藥物組MAP-2表達(dá)增高說明MDP可促進(jìn)樹突形成，從而促進(jìn)新突觸形成，改善突觸可塑性，增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力；另一方面，藥物組大鼠SYP與PSD-95也明顯升高，說明MDP能夠保存現(xiàn)有突觸，并促進(jìn)了突觸重建與再生，從而保護(hù)了缺血缺氧損傷的神經(jīng)組織。PSD-95與MAP-2表達(dá)增加，也提示神經(jīng)元樹突的生成和樹突棘的增多和成熟，為突觸重建創(chuàng)造了條件。電鏡觀察也證實(shí)MDP治療后大鼠突觸結(jié)構(gòu)正常，尺寸增大，突觸囊泡豐富，這些為神經(jīng)信息的高效傳遞和處理創(chuàng)造了物質(zhì)條件。模型組突觸間隙消失，突觸前后膜界限不清，正常曲面消失，突觸囊泡減少或消失，線粒體嵴腫脹及破壞。相應(yīng)的SYP、MAP-2、PSD-95表達(dá)均顯著低于假手術(shù)組及藥物組，表明突觸破壞、萎縮乃至消失，與其學(xué)習(xí)記憶能力降低不無關(guān)聯(lián)。

綜上所述，MDP通過補(bǔ)腎填精、益氣通絡(luò)，使腎氣健旺、腦絡(luò)通順、五臟得調(diào)，從而改善VD患者的認(rèn)知功能。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方能促進(jìn)突觸再生，增強(qiáng)突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95、MAP-2的表達(dá)，保證了突觸正常的生理結(jié)構(gòu)和功能，為高效有序地處理神經(jīng)信息提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為MDP在臨床上的推廣應(yīng)用提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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