章莉 朱軍 賀再清 陳敬 周靜秋 陳麗娟

(核工業(yè)四一六醫(yī)院核應急分隊，四川 成都 610051)

日本Fukushima核事故之后，國際醫(yī)生防止核戰(zhàn)爭聯(lián)盟發(fā)表的《切爾諾貝利核災難25年后的健康影響》中[1]的重要發(fā)現(xiàn)：核廢清理者的非癌癥疾病“早衰”遠超過惡性腫瘤及白血病的發(fā)病率。而在這之前，惡性腫瘤與白血病則是輻射損傷發(fā)病的首位[5]。

輻射所致早衰的機制復雜，研究證實造血干細胞以及內(nèi)皮細胞的損傷是輻射所致早衰的始動因素，通過應激介導的早衰(Stress-induced premature senescence，SIPS)激活p53-p21-pRb信號途徑，多種細胞因子參與和表征了細胞衰老，從而發(fā)生器官及系統(tǒng)性的早衰[2-3]。造血細胞龕，是維持造血干細胞的生理功能重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。動物實驗發(fā)現(xiàn)[4]，造血細胞龕的損傷是輻射早衰的另一個重要機制，骨內(nèi)膜龕中的成骨細胞以及與其作用相反的破骨細胞參與了輻射早衰的發(fā)生。骨特異性堿性磷酸酶(Serum bone alkaline phosphates，BALP)[7]，由成骨細胞產(chǎn)生，其變化可反映成骨細胞的活性；抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(Tartrate-resistant acid phosphatase isoform-5b，TRACP-5b)來源于破骨細胞，檢測其外周血的變化，可以了解破骨細胞活性。

前瞻性觀察不同工齡段的核從業(yè)人員的造血龕早衰細胞因子的變化，根據(jù)這些變化調(diào)整制定更完備的職業(yè)防護，核從業(yè)的職業(yè)防護是核安全具體實施是一重要內(nèi)容。本研究擬觀察核從業(yè)人員外周血BALP以及TRACP-5b的變化，了解造血細胞龕的功能。

1 臨床資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般資料及分組

選取2015年9月至2016 年2月在我院體檢的在川某核單位體檢的核從業(yè)人員，共216人次作為研究對象。并以不同核從業(yè)工齡時間分為5組：即0～3年組，3～8年組，8～15年組，15～25年組，>25年組。同時選取非涉核正常體檢41人次作為對照。

1.1.2 排除標準

a)染色體有畸變或微核者；b)BMI≥24；c)血清尿酸、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白超出實驗室正常上限及下限的核從業(yè)人員； d)不愿接受研究或不能夠依從研究要求的核從業(yè)人員。

1.1.3 主要試劑與儀器

SpectraMax?iD3型酶標儀(Molecular Devices公司，美國)；Aquamax2000洗板機(Molecular Devices公司，美國)；X-15R型臺式高速離心機(貝克曼公司，美國)；人骨特異性堿性磷酸酶ELISA試劑盒(BIM Biosciences公司，美國)，人細胞間粘附分子-1ELISA試劑盒(BIM Biosciences公司，美國)。

1.2 方法

用不含抗凝劑的帶有分離膠的真空采血管采集清晨(早晨6:00～8:00)空腹靜脈血2-3 ml，25 ℃室溫靜置1～2 h，4000 rpm離心10 min，取血清分裝至100 μl eppendorf管，于-80 ℃冰箱保存。血樣從-80 ℃冰箱取出后，于25 ℃室溫環(huán)境下自然解凍80 min。應用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測定血清BALP以及TRACP-5b的濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本數(shù)據(jù)比較

216例核從業(yè)人員根據(jù)工齡分為“0～3年”組；“3～8年”；“8～15年”；“15～25年”；“>25年”共5組及正常對照組。各組例數(shù)，中位年齡，體重指數(shù)；淋巴細胞數(shù)；C反應蛋白；類風濕因子；球蛋白；紅細胞沉降率，經(jīng)統(tǒng)計分析，P>0.05，各組間基數(shù)無顯著的統(tǒng)計學差異，見表1。

表1 研究對象的基本數(shù)據(jù)

2.2 血清骨特異性堿性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶5b的測定

不同工齡組與正常組BALP及TRACP-5b的表達采用方差分析，發(fā)現(xiàn)兩者均P<0.05，表明組間存在顯著差異。再通過LSD兩兩比較分析， 發(fā)現(xiàn)對于BALP值，工齡15～25年組比工齡0～3年組，3～8年組，8～15年組及正常對照組明顯降低(P<0.05)；對于TRACP-5b值，工齡15～25年組比工齡0～3年組，3～8年組，>25年組及正常對照組明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 不同工齡組的核從業(yè)人員的血清BALP以及TRACP-5b的表達

注：與15～25年組相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

3 討論

多種應激原，包括電離輻射作用于機體，機體細胞內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)增多，抗氧化系統(tǒng)失去穩(wěn)態(tài)，以SIPS機制，激活細胞內(nèi)p53-p21-pRb等多條信號通路，介導細胞早衰。動物研究證實[8]，衰老細胞具有衰老相關(guān)分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype,SASP)，會分泌出炎癥性細胞因子影響周圍細胞，加速周圍組織細胞衰老，從而導致器官衰老相關(guān)表型的相繼發(fā)生。國際醫(yī)生防止核戰(zhàn)爭聯(lián)盟關(guān)于切爾諾貝利的健康影響報告中指出，核廢清理者骨骼系統(tǒng)的早衰增加了53倍，電離輻射對骨髓龕的損傷是其發(fā)生的原因[1]。成骨細胞是骨內(nèi)膜龕的重要組成部分，破骨細胞的活性是與成骨細胞的活性相耦聯(lián)的，因此，通過了解成骨細胞細胞與破骨細胞的活性可以了解骨髓龕的功能狀態(tài)。

正常生理狀態(tài)下，年齡增長55歲之后，外周血BALP表達漸減少；TRACP-5b表達增高[9]。本研究根據(jù)工齡將核從業(yè)人員分為五組的觀察發(fā)現(xiàn)，在五組核從業(yè)人員間，隨著工齡的增加，BALP的表達水平降低，而TRACP-5b而表達增加，這與非涉核正常人群體檢結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，由于衰老細胞具有衰老相關(guān)分泌表型(SASP)，會分泌出炎癥性細胞因子影響周圍細胞，促進周圍組織細胞的衰老并且會促進癌癥的發(fā)生骨髓龕的活性逐漸減退，表現(xiàn)為成骨細胞功能減退[6]，破骨細胞的活性增強。本研究觀察到的這一結(jié)果與相關(guān)研究所觀察到的是一致的。

本研究還觀察到，“15～25”年工齡的核從業(yè)人員組中，BALP是最低，TRACP-5b最高?！?5～25年”工齡組的核從業(yè)人員，中位年齡為38歲，體重指數(shù)及淋巴細胞等實驗室指標與其他組及對照組，沒有明顯差異。而BALP顯著減低，TRAP-5b顯著增高，這些細胞因子的變化提示其信號通路的上游的環(huán)節(jié)發(fā)生了變化。最近的研究表明，基因組的不穩(wěn)定性在電離輻射等多種應激原導致衰老的過程中有重要作用，基因組的不穩(wěn)定通過改變蛋白的質(zhì)或量使其改變正常功能，促進了衰老表型的產(chǎn)生，導致組織穩(wěn)態(tài)被打破等，繼而出現(xiàn)細胞衰老至器官衰老的逐級發(fā)生。根據(jù)本研究所觀察到的“15～25”年工齡的核從業(yè)人員組中，BALP是最低，TRACP-5b最高的這一結(jié)果，可以推測p53-p21-pRb信號通路上游的基因組存在不穩(wěn)定性。因此，下一步的研究可以針對該年齡段的核從業(yè)人員進行追蹤隨訪，重點關(guān)注骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)早衰疾病的發(fā)生。為深入探討輻射引起早衰的生物學機制提供相關(guān)的數(shù)據(jù)分析，也為建立更細化的職業(yè)防護依據(jù)有著極為現(xiàn)實的意義。

1 Cologne JB, Preston DL.Longevity of atomic-bomb survivors[J]. Lancet, 2000, 356(9226): 303-307.

2 VanDeursen JM. The role of senescent cells in ageing[J]. Nature, 2014, 509(7501): 439-446.

3 Thomas Kirkwood. Understanding the odd science of aging[J]. Cell, 2005, 120: 437-447.

4 Darren J Baker, Bennett G Childs, Matej Durik, et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan[J]. Nature, 2016, 530(7589): 184-189.

5 Wald Schmidt JG,Braunstein EM, Buckwalter KA. Magnetic resonance imaging of osteoarthritis[J]. Rheu Dis Clin North Am, 1999, 25(2): 451-456.

6 景鵬偉,胡文煦,宋小英,等. 衰老大鼠模型骨髓基質(zhì)細胞的生物學特點[J]. 解剖學報, 2015, 46(1): 44-50.

7 Kim HJ, OhkB, Kang WY, et al. Deficiency of lipocalin-2 promotes proliferation and differentiation of osteoclast precursors via regulation of c-fms expression and nuclear factor-kappa B activation[J]. Bone Metab, 2016, 23(1): 8-15.

8 Miyamoto T. Role of osteoclasts in regulating hematopoietic stem and progenitorcells[J]. World J Orthop， 2013, 4(4): 198-206.

9 Mdndez-Ferrer S, Michurina TV, Ferraro F,et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche[J]. Nature, 2010, 466(7308): 829-834.