王先偉，陳 東，李召磊

(大連市中心醫(yī)院 神經(jīng)外三科，遼寧 大連116033)

微小RNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼的小分子RNA的一個種類，大約只有18-25 個bp的長度。在動物基因組中，它大多以單拷貝、多拷貝或基因簇等形式廣泛存在著。它雖然只是占人類基因組的約1%的內(nèi)容，但是人類將近三成的基因卻受其調(diào)節(jié)。它不但可作為癌基因存在，也可以作為抑癌基因而起到作用。在Mitchell等人[1]的研究中已證明外周血血漿中存在穩(wěn)定的miRNA。miR-21是一種廣泛存在于人類組織細胞中的，而且被發(fā)現(xiàn)較早的一類微小RNA。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-21在包括原發(fā)性腦淋巴瘤在內(nèi)的多種實體腫瘤中均表達過高[2，3]，在疾病進展中極其可能發(fā)揮著癌基因的作用。在神經(jīng)外科臨床診斷中原發(fā)性腦淋巴瘤與腦膠質(zhì)母細胞瘤鑒別起來十分困難，本研究通過檢測原發(fā)性腦淋巴瘤患者、腦膠質(zhì)母細胞瘤患者血漿中miR-21的表達，探討其作為原發(fā)性腦淋巴瘤淋巴瘤特異性標(biāo)志物對診斷、療效及預(yù)后評價的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑，DL1000 DNA Ladder 均購自大連寶生物試劑公司。TRIzol 試劑購于美國 Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×Tap PCR MasterMix購于天根生化科技有限公司，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。PCR 儀購于 ABI 公司。

1.2 病例分組

大連市中心醫(yī)院神經(jīng)外科 2015年7月-2017年7月收治的原發(fā)性腦淋巴瘤患者20 例，腦膠質(zhì)母細胞瘤患者20例，男女比例約為1∶1，年齡 22-75歲(中位年齡 50 歲)，均經(jīng)手術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診。采血時間均為術(shù)前。

1.3 標(biāo)本采集與預(yù)處理

采用抗凝管采集所有研究對象外周血5 ml，2000轉(zhuǎn)離心12 min，將上層血漿轉(zhuǎn)移至潔凈EP管，再以15000 轉(zhuǎn)離心12 min，吸取上層血漿于潔凈 EP 管，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

取1 ml血漿加入EP管中，75℃加熱5 min，42℃溫育 1 h 后利用TRIzol試劑進行樣本中RNA 的提取與純化，得到純化后的血漿 RNA 樣本。RNAiso后勻漿氯仿抽提，異丙醇沉淀。逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。PCR反應(yīng)體系：滅菌水 28.75 μl，5×PCR buffer 10 μl，上下游引物各0.5 μl，TaKaRa E×TaqHS 0.25 μl，cDNA 10 μl，共50 μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 50 s，72℃ 50 s，72℃ 10 min，35個循環(huán)。取5 μl RT-PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝圖，電泳圖像采用gel pro 4.5圖像分析軟件分析平均光密度值，以同一標(biāo)本的目的基因與GAPDH平均光密度比值反應(yīng)目的基因mRNA表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，所有統(tǒng)計均為雙側(cè)，顯著性檢驗水準(zhǔn)取α=0.05，以P<0.05代表有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳可見條帶為22 bp，有miR-21表達，與腦膠質(zhì)母細胞瘤組相比，原發(fā)性腦淋巴瘤組miR-21表達明顯升高(P<0.01)，兩組間差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

3 討論

表1 兩組miR-21表達水平比較(x±s)

注：兩組相比，P<0.01

miR-21是一種非常重要的微小RNA，它在多種腫瘤細胞中的表達均出現(xiàn)顯著異常，尤其是在淋巴系統(tǒng)腫瘤中意義非凡，這當(dāng)然也包括原發(fā)性腦淋巴瘤。多種研究證實， miR-21具有重要的臨床意義：它作為一種原癌微小RNA，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可用于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后。然而由于現(xiàn)在人們對 miR-21的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制、靶基因以及其靶基因的作用機制缺乏更加深入的了解，從而無限限制了miR-21在臨床上的應(yīng)用。

原發(fā)性腦淋巴瘤原是臨床上較為罕見的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，然而近年來其發(fā)病率及檢出率逐漸上升。因為淋巴瘤對于放療及化療敏感，是可治愈的腫瘤，所以準(zhǔn)確診斷腦淋巴瘤對本病的治療效果至關(guān)重要。在神經(jīng)外科臨床診斷過程中，手術(shù)前的影像學(xué)診斷至關(guān)重要，而原發(fā)性腦淋巴瘤與腦膠質(zhì)母細胞瘤在增強MRI上影像十分相似，往往二者需要通過術(shù)后的病理學(xué)來鑒別。這樣一來給患者造成了手術(shù)創(chuàng)傷，甚至延誤的病情，因為淋巴瘤可以通過放化療明顯改善。而通過本研究可以發(fā)現(xiàn)，若是在術(shù)前鑒別診斷困難時，進行外周血的miR-21監(jiān)測，可以有效判斷出是否為淋巴瘤，進而為診斷提供新思路，避免很多弊端。

本研究發(fā)現(xiàn)，血漿中miR-21的表達水平在原發(fā)性腦淋巴瘤患者組顯著均高于腦膠質(zhì)母細胞瘤組。目前已經(jīng)有研究結(jié)果表明[4]：檢測血漿中 miR-21的表達量對淋巴瘤的正確診斷率可達到85.7%。這提示，血漿中檢測 miR-21的表達量有助于早期原發(fā)性腦淋巴瘤的診斷，對臨床懷疑為原發(fā)性腦淋巴瘤患者，影像學(xué)與腦膠質(zhì)母細胞瘤類似，而且患者無法開顱取病理，化驗其血中miR-21的表達量可以幫助其早期診斷。

參考文獻：

[1]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al．Circulating microRNAs as stable blood based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008,105(30):10513.

[2]Selcuklu SD,Donoghue MT,Spillane C.miR-21 as a key regulator of oncogenic processes[J].Biochem Soc Trans,2009,37(4):918.

[3]張保貴，劉炳亞，燕 敏.miR-21與腫瘤的研究進展[J]．國際外科學(xué)雜志，2011，38(4)：262.

[4]葛甜甜，梁 勇，付 蓉,等.淋巴瘤患者血漿中MIR-21、MIR-155、MIR-210的表達及臨床意義[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2012,20(2):305.