張俊志，張中軍，趙 雷，蔡興濤，李 瑩，崔媛媛

(深圳市人民醫(yī)院·暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院 麻醉科，廣東 深圳518020)

肺泡上皮細胞的主要功能是維持肺泡液體的動態(tài)平衡，促進肺泡多余液體的清除，從而提供最佳的氣體交換功能[1]。然而，在急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)過程中，肺泡-毛細血管屏障受損，使得肺泡液體增多，并造成肺泡液體清除功能下降，導(dǎo)致嚴重的氣體交換障礙[2]。鈉離子在肺泡上皮細胞的轉(zhuǎn)運促使了肺泡液的轉(zhuǎn)運，是肺水腫液清除的主要驅(qū)動力[3]。肺泡上皮鈉離子通道(ENaC)分布于細胞膜頂端，由3種亞型(α、β、γ)構(gòu)成，調(diào)控鈉離子的轉(zhuǎn)運，在肺泡水腫液體的清除過程中發(fā)揮重要作用[4]。

本研究選擇3種急性肺損傷實驗?zāi)Ｐ图粗嗵?LPS)誘導(dǎo)、鹽酸(HCl)誘導(dǎo)和機械通氣(VILI)引起的肺損傷，對鈉離子通道(ENaC)3種亞型(α、β、γ)的作用，從而反映不同急性肺損傷的共同潛在原因，為促進肺泡水腫液清除和治療肺損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

40只雄性SD大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；小動物呼吸機(型號R407)購自中國瑞沃德公司；總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；qRT-PCR試劑盒購自美國Thermofisher Scientific公司；Western blot檢測試劑盒購自美國Upstate Biotechnology公司。

1.2 實驗動物分組及急性肺損傷模型制作

清潔級雄性 SD 大鼠 40只，體質(zhì)量 220-240 g，隨機分為4組(n=10)。對照組(Control組)于氣管內(nèi)滴注2 ml/kg生理鹽水，24 h后處死；脂多糖誘導(dǎo)組(LPS組，n=10)氣管內(nèi)滴注5 mg/kg 脂多糖，24 h后處死；鹽酸誘導(dǎo)組(HCL組，n=10)氣管內(nèi)滴注2 ml/kg鹽酸(pH=1.8)，24 h后處死；機械通氣組(VILI組，n=10)采用小動物呼吸機，使用25 ml/kg的高潮氣量和50次呼吸/分鐘的呼吸率對大鼠進行通氣，機械通氣4 h后將大鼠處死。

1.3 支氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)蛋白濃度和白細胞計數(shù)

各組處死大鼠后立即開胸取肺，切開右肺主支氣管，插入外徑為1.8 mm的氣管插管軟管固定，左肺結(jié)扎，用每份3 ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)連續(xù)灌洗右肺3次，并回收灌洗液，最后將回收BALF合并，取出80 μl BALF，離心染色并進行白細胞計數(shù)。將剩余的BALF，4℃以1 500 r/min離心20 min，取上清液儲存在-80℃冰箱保存，用于測定蛋白濃度。

1.4 實時定量PCR(qRT-PCR)檢測鈉通道各亞型mRNA的表達

取左肺肺組織，按總RNA提取試劑盒說明進行操作，用分光光度法在260和280 nm測定總RNA濃度和質(zhì)量，同時用甲醛瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性，將總RNA保存在-80℃。實時定量PCR分析采用qRT-PCR試劑盒和熒光染料摻入法進行，按試劑盒說明進行操作，用于擴增GAPDH(內(nèi)源參照基因)以及不同的ENaC靶基因mRNA序列，根據(jù)美國Thermofisher公司生物技術(shù)信息序列數(shù)據(jù)庫和程序的信息設(shè)計基因特異性引物組，引物序列如表1。參照說明，在95℃孵化30 s后，再以95℃10s PCR循環(huán)35次，60 ℃20 s和72℃20 s，最后β-Actin或GAPDH為內(nèi)參，熔解曲線分析。

表1 引物序列

1.5 Westen-bolt法檢測鈉通道各亞型蛋白的表達

取左肺組織加1 ml裂解液，然后12 000 r/min 4℃離心2 min，取少量上清Lowry 法測定總蛋白量。每孔蛋白加樣量為20 μg，通過80-100V電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜在100V在冷水浴1 h。PVDF膜與PBS含BSA封閉1 h，并孵育抗體(1∶1 000)在4℃，PVDF膜過夜，用PBST洗滌3次，再與HRP標記的二抗孵育(1∶10 000)在37℃ 1 h，與PBST洗3次后，按Western blot檢測試劑盒說明進行快速孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影，將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BALF蛋白濃度和白細胞計數(shù)結(jié)果

與Control組比較，LPS組、HCL組和VILI組BALF蛋白濃度和白細胞計數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 BALF蛋白濃度和白細胞計數(shù)

注：與對照組比較aP<0.05

2.2 qRT-PCR檢測mRNA的表達結(jié)果

與Control組比較，α-ENaCmRNA表達在LPS組和HCL組中明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而α-ENaCmRNA表達在VILI組與Control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；β-ENaCmRNA表達各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Control組比較，γ-ENaCmRNA在VILI組表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在LPS組和HCL組表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

注：與Control組比較，*表示 P<0.05。

2.3 Westen-bolt法檢測鈉通道各亞型蛋白表達結(jié)果

與Control組比較，α-ENaC蛋白表達在LPS組和HCL組明顯降低(P<0.05)，而γ-ENaC蛋白表達在VILI組明顯降低(P<0.05) ，見圖2。

3 討論

急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床上常見的危重病癥，其特征是彌漫性肺泡損傷，毛細血管通透性增加和凝血系統(tǒng)的強烈激活。ARDS誘發(fā)因素(如敗血癥、創(chuàng)傷、誤吸和肺炎等)相當常見，但只有少數(shù)患者發(fā)展為綜合征,這種差異性反應(yīng)提示可以對ARDS易感性和預(yù)后的潛在因素進行研究。

圖2 ENaC各亞型蛋白表達(n=10)

阿米洛利敏感上皮鈉通道(ENaC)，在健康和疾病中發(fā)揮重要作用，在腎，結(jié)腸和肺中均有表達[5]。ENaC通過重吸收頂膜上的Na+參與維持適宜的鹽和水平衡，從而形成促進液體重吸收的滲透梯度，Na+在肺泡上皮細胞的轉(zhuǎn)運促使了肺泡液的轉(zhuǎn)運，是肺水腫液清除的主要驅(qū)動力。ENaC調(diào)控Na+的轉(zhuǎn)運，在肺泡水腫液體的清除過程中發(fā)揮重要作用[6-9]。ENaC由α，β和γ亞基組成，有研究表明，缺乏α-ENaC表達的新生小鼠由于無法清除肺泡內(nèi)多余的液體,在出生后48 h 內(nèi)死亡[10]。Mall等[11]發(fā)現(xiàn)，β-ENaC過度表達導(dǎo)致肺泡上皮Na+攝取增加，導(dǎo)致肺部脫水并引起肺囊性纖維化樣變。Naomi等[12]研究人呼吸道上皮ENaCmRNA水平與細胞上皮基底部電位差(PD)之間的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，PD 的降低與γ-ENaCmRNAs表達水平的升高存在相關(guān)關(guān)系,而α或β-ENaCmRNA的水平與PD 之間沒有相關(guān)關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示3種急性肺損傷實驗?zāi)Ｐ虰ALF蛋白濃度和白細胞計數(shù)均顯著升高(P<0.05)，提示3種模型均使肺泡壁通透性增加及氣血屏障的完整性被破壞。本研究發(fā)現(xiàn)α-ENaCmRNA表達和蛋白的表達在LPS組和HCL組中明顯降低(P<0.05)，提示這兩組損傷作用可能主要發(fā)生在肺泡上皮頂膜上Na+電導(dǎo)所必需的α亞基，損害肺泡上皮液體輸送功能，導(dǎo)致肺泡液體清除作用降低。本研究還發(fā)現(xiàn)γ-ENaCmRNA表達和蛋白的表達在VILI組明顯降低(P<0.05)，提示高潮氣量的機械通氣損傷作用于可能是抑制了上皮細胞增強信號通路的γ亞基的表達。而β-ENaCmRNA表達和蛋白的表達在肺損傷實驗?zāi)Ｐ椭袩o明顯變化(P>0.05)，提示β亞基表達水平可能在肺損傷模型中不會降低。

本研究通過對3種急性肺損傷實驗?zāi)Ｐ虴NaC各亞基的檢測，表明肺損傷具有靶向特異性調(diào)節(jié)基因和蛋白質(zhì)表達，從而反映不同急性肺損傷的共同潛在原因，為促進肺泡水腫液清除和治療肺損傷提供依據(jù)。

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