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        小麥面筋蛋白去酰胺與磷酸化改性的研究

        2018-06-28 10:01:28張玲玲李永祥
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2018年11期
        關(guān)鍵詞:面筋酰胺磷酸化

        張玲玲,李永祥

        (天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院,食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

        小麥?zhǔn)莾H次于玉米的世界上第二大糧食作物,幾乎全部經(jīng)過(guò)深加工成為淀粉后用于食用,在這個(gè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物,小麥面筋蛋白就是其中之一。因?yàn)樾←溍娼畹鞍拙哂袃?yōu)良的延展性、黏彈性、薄膜成型性等物理特性,常作為烘焙食品的添加劑使用[1]。然而,因?yàn)樾←溍娼畹鞍字械氖杷被彷^多,溶解性較低,使得它的乳化性、起泡性、持水吸油性等性質(zhì)都不理想,最終限制了其在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用,所以通過(guò)對(duì)小麥面筋蛋白進(jìn)行改性以期得到功能性質(zhì)更好的蛋白質(zhì)。

        植物蛋白的改性方法有物理改性、化學(xué)改性、酶法改性和基因工程改性等[2]。物理改性是通過(guò)適度的熱變性、添加增稠劑、機(jī)械處理、擠壓、冷凍、質(zhì)構(gòu)化和超聲波等方式改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間的聚集方式,從而改善植物蛋白的功能性和營(yíng)養(yǎng)特性,但對(duì)設(shè)備要求較高,且較難展開(kāi)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用生產(chǎn)[3]。酶法改性雖反應(yīng)條件溫和,但專(zhuān)一性強(qiáng),需要一定的前處理,反應(yīng)速度較化學(xué)方法慢得多,生產(chǎn)周期長(zhǎng)且成本昂貴,故在食品中的應(yīng)用仍不多[4]?;蚬こ碳夹g(shù)周期長(zhǎng)、見(jiàn)效慢,目前仍處于實(shí)驗(yàn)室階段,尚未在生產(chǎn)中應(yīng)用[5]?;瘜W(xué)改性反應(yīng)時(shí)間短、成本低,對(duì)設(shè)備要求不高,且改性效果明顯,因此化學(xué)改性仍然是蛋白質(zhì)改性的主流方向[6]。Matheis G等人[7]認(rèn)為利用三聚磷酸鈉對(duì)蛋白質(zhì)的改性是安全可行的,它不但改善了蛋白質(zhì)的功能特性,而且不會(huì)影響蛋白質(zhì)在體內(nèi)的消化率。唐文婷等人[8]指出利用三聚磷酸鈉對(duì)蛋白質(zhì)的改性可以很好地提高蛋白質(zhì)的水溶性、起泡性等。因此,選擇去酰胺與磷酸化復(fù)合改性的方法對(duì)小麥面筋蛋白進(jìn)行改性,以提高其功能性質(zhì),擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。改性后的小麥面筋蛋白可作為脂肪模擬物應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)飲料、嬰幼兒奶粉、脂肪模擬物等食品中替代部分甚至全部脂肪[9]。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        小麥面筋蛋白(食品級(jí)),河南潤(rùn)誠(chéng)化工產(chǎn)品有限公司提供;醋酸、三氯乙酸(分析純),天津市化學(xué)試劑一廠(chǎng)提供;多聚磷酸鈉、磷酸氫二、磷酸二氫鈉(分析純),天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠(chǎng)提供;大豆色拉油(食品級(jí)),嘉里糧油(天津)有限公司提供;十二烷基磺酸鈉(分析純),天津市佳興化工有限公司提供。

        高溫立式殺菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)產(chǎn)品;Evolution300型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 去酰胺與磷酸化改性小麥面筋蛋白的制備方法

        稱(chēng)取一定量的小麥面筋蛋白溶于0.082 mol/L的醋酸溶液中,配成10%(W/V)的小麥面筋蛋白懸浮液,將其置于水浴鍋中于25℃條件下水化2 h,將得到的樣品懸浮液于121℃滅菌鍋中濕熱處理15 min,(待殺菌鍋預(yù)熱到近100℃時(shí)放入樣品),然后快速放氣,取出樣品后立即冰浴冷卻停止反應(yīng)[10]。

        用1 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值,磁力加熱攪拌時(shí)分批等量加入一定量的多聚磷酸鈉,反應(yīng)過(guò)程中用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH值,維持在加入多聚磷酸鈉前的固定值,維持溫度恒定。反應(yīng)結(jié)束后冷卻,調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH值為7.0,于4℃條件下透析24 h,以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min后去上清液,冷凍干燥,粉碎保存。

        1.2.2 磷酸化程度的測(cè)定方法

        采用EDTA滴定法:①用移液槍移取磷酸化反應(yīng)結(jié)束后的上清液5 mL于離心管中,加入過(guò)量的10%的三氯乙酸溶液于離心管中用于沉淀蛋白質(zhì)(約20mL),在高速離心機(jī)上以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心5 min;②將上清液倒出,給上清液中加入過(guò)量的醋酸鋅固體(約0.5 g),同時(shí)用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)上清液的pH值在3.8~3.9,會(huì)有大量的絮狀沉淀出現(xiàn),沉淀主要是焦磷酸鋅,在高速離心機(jī)上以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心5 min;③將離心獲得的沉淀用氨緩沖溶液(pH值10) 溶解(約30 mL);④用0.01 mol/L的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定Zn2+,用鉻黑T作為指示劑,當(dāng)溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)即為滴定的終點(diǎn);⑤用所用的EDTA的體積表示磷酸化的程度大小。

        1.2.3 小麥面筋蛋白乳化性及其乳化穩(wěn)定性的測(cè)定[11]

        取30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%(W/V) 的蛋白溶液(溶于0.01 mol/L,pH值7的磷酸鹽緩沖液)和10 mL玉米油,用均質(zhì)機(jī)以轉(zhuǎn)速20 000 r/min,溫度20℃的條件下均質(zhì)1 min。用移液槍迅速?gòu)牡撞课?00 μL溶液,用配制好的0.1%SDS溶液將其定容至50 mL,于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定其吸光度A0,靜置10 min后,根據(jù)上述同樣操作再次取樣,測(cè)定吸光度At。以SDS溶液為空白,做3個(gè)平行。

        以乳化活力指數(shù)EAI表示:

        式中:EAI——每克蛋白質(zhì)的乳化面積,m2/g;

        N——稀釋倍數(shù);

        A0——500 nm下0時(shí)刻的吸光度;

        L——比色池光徑(1 cm);

        φ——體系中油相所占的分?jǐn)?shù),試驗(yàn)中油相占0.25;

        C——蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度,g/mL。

        乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)表示:

        式中:A0——0時(shí)刻的吸光度;

        At——t時(shí)刻的吸光度;

        ΔT——時(shí)間差,10 min。

        1.2.4 小麥面筋蛋白起泡性及其起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

        取70 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%(W/V) 的蛋白溶液(溶于0.01 mol/L,pH值7的磷酸鹽緩沖液)于100 mL離心管中,用均質(zhì)機(jī)在轉(zhuǎn)速20 000 r/min,溫度20℃條件下均值1 min,立刻倒入量筒中,記錄泡沫體積V0。于30 min后記錄體積V30。計(jì)算其起泡性和泡沫穩(wěn)定性。起泡性計(jì)算公式如下:

        式中:V0——均質(zhì)后體積,mL;

        V——取樣體積,mL。

        起泡穩(wěn)定性計(jì)算公式如下:

        式中:V30——靜置30 min后體積,mL;

        V0——均質(zhì)后體積,mL;

        V——取樣體積,mL。

        1.2.5 小麥面筋蛋白持水性及吸油性的測(cè)定

        稱(chēng)取0.1 g的改性后的蛋白質(zhì)樣品于離心管中,加入適量的水(大豆色拉油) 將樣品完全浸泡,然后用漩渦混合器振蕩1 min,用高速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min,取出后去上清液,稱(chēng)質(zhì)量。則持水(吸油)性的計(jì)算公式如下:

        式中:m0——WGP樣品的質(zhì)量,g;

        m1——樣品加離心管的質(zhì)量,g;

        m2——離心后離心管加沉淀的質(zhì)量,g。

        1.2.6 小麥面筋蛋白的傅里葉紅外光譜測(cè)定

        準(zhǔn)確稱(chēng)量1 mg樣品與150 mg干燥的溴化鉀,用瑪瑙研缽將其充分研磨至細(xì)末貼壁,顆粒直徑2 μm左右。使用壓片機(jī)將混合粉末壓制成透明薄片,用紅外光譜儀做全波段掃描(4 000~400 cm-1),掃描次數(shù)為16次,分辨率為4%,以空氣為采集背景,樣品紅外光譜圖經(jīng)過(guò)傅立葉變換得到。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 未改性小麥面筋蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

        對(duì)未改性小麥面筋蛋白的功能與性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定和分析。

        未改性與去酰胺小麥面筋蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 未改性與去酰胺小麥面筋蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

        由表1可知,未改性小麥面筋蛋白的起泡性、乳化性等功能特性都相對(duì)較差,這就限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。去酰胺改性后,小麥面筋蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性、持水和吸油性都有明顯的提高[11]。然而,經(jīng)過(guò)去酰胺改性后的小麥面筋蛋白溶于水之后依舊呈現(xiàn)一種面筋狀,因此對(duì)于去酰胺小麥面筋蛋白進(jìn)行磷酸化改性考查其功能性質(zhì)。

        2.2 磷酸化改性小麥面筋蛋白的研究

        在磷酸化改性的過(guò)程中,選擇反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度和磷酸化試劑的添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn),每組單因素選擇5個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

        2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷酸化改性的影響

        反應(yīng)pH值9.0,反應(yīng)溫度25℃,磷酸化試劑添加量15%(多聚磷酸鈉質(zhì)量/小麥面筋蛋白質(zhì)量),考查反應(yīng)時(shí)間為10,20,30,40,50 min時(shí)對(duì)小麥面筋蛋白磷酸化改性的影響。選擇5個(gè)時(shí)間點(diǎn),通過(guò)5個(gè)時(shí)間梯度EDTA的用量來(lái)確定磷酸化的程度,以此來(lái)判斷什么時(shí)間磷酸化的程度最高、反應(yīng)最徹底。

        反應(yīng)時(shí)間對(duì)小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響見(jiàn)圖1。

        圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響

        由圖1可知,在加入磷酸化試劑的0~30 min內(nèi),反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)反應(yīng)越徹底;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)30 min時(shí),磷酸化反應(yīng)程度反而減低;達(dá)到40 min時(shí),反應(yīng)趨于穩(wěn)定。由此,反應(yīng)時(shí)間在30 min時(shí)磷酸化程度最大、反應(yīng)最徹底。

        反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合改性產(chǎn)物功能性質(zhì)的影響見(jiàn)表2。

        表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合改性產(chǎn)物功能性質(zhì)的影響

        由表2可知,在30 min之前,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)物的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性均逐漸增強(qiáng),超過(guò)30 min后,功能性質(zhì)均逐漸下降,這與磷酸化反應(yīng)程度的變化相一致。所以最佳反應(yīng)時(shí)間是30 min。且通過(guò)比較復(fù)合改性和去酰胺改性后蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)發(fā)現(xiàn),復(fù)合改性的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性均有所提高,且復(fù)合改性后的產(chǎn)物溶于水之后不會(huì)有面筋形成。

        2.2.2 反應(yīng)pH值對(duì)磷酸化改性的影響

        反應(yīng)時(shí)間40 min,反應(yīng)溫度25℃,磷酸化試劑添加量15%,考查反應(yīng)pH值為5,7,9,11,13時(shí)對(duì)小麥面筋蛋白磷酸化改性的影響。

        反應(yīng)pH值對(duì)小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響見(jiàn)圖2。

        圖2 反應(yīng)pH值對(duì)小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響

        由圖2可知,反應(yīng)pH值在5~9時(shí),磷酸化程度先降低后升高,反應(yīng)pH值在11~13時(shí),磷酸化程度明顯降低,當(dāng)反應(yīng)pH值為9時(shí)磷酸化程度達(dá)到最大,推測(cè)蛋白質(zhì)在堿性較大的情況下會(huì)發(fā)生變性,從而影響磷酸化,使蛋白質(zhì)的磷酸化程度降低[12]。

        反應(yīng)pH值對(duì)小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響見(jiàn)表3。

        當(dāng)反應(yīng)pH值為9時(shí),其乳化性、起泡性相比其他反應(yīng)pH值較高,雖然反應(yīng)pH值為13時(shí)乳化和起泡性均較高,但是堿性太大、蛋白質(zhì)容易變性,所以選擇pH值9為最佳改性條件。

        2.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)磷酸化改性的影響

        反應(yīng)時(shí)間40 min,反應(yīng)pH值9,磷酸化試劑添加量15%,考查反應(yīng)溫度為25,35,45,55,65℃時(shí)對(duì)小麥面筋蛋白磷酸化改性的影響。

        表3 反應(yīng)pH值對(duì)小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響

        反應(yīng)溫度對(duì)于小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響見(jiàn)圖3。

        圖3 反應(yīng)溫度對(duì)于小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響

        隨著反應(yīng)溫度的升高,磷酸化程度逐漸增大,當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到45℃時(shí)磷酸化程度最高,當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)45℃時(shí)磷酸化程度迅速下降。

        反應(yīng)溫度對(duì)小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響見(jiàn)表4。

        表4 反應(yīng)溫度對(duì)小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響

        在反應(yīng)溫度為45℃時(shí)產(chǎn)物的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性最好。因此,最佳反應(yīng)溫度為45℃。

        2.2.4 磷酸化試劑添加量對(duì)磷酸化改性的影響

        反應(yīng)時(shí)間40 min,反應(yīng)pH值9,反應(yīng)溫度25℃,考查磷酸化試劑添加量為5%,10%,15%,20%,25%時(shí)對(duì)小麥面筋蛋白磷酸化改性的影響。

        磷酸化試劑添加量對(duì)于小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響見(jiàn)圖4。

        隨著磷酸化試劑添加量的增多,磷酸化的程度逐漸變大,當(dāng)磷酸化試劑添加量達(dá)到25%時(shí)磷酸化程度最大,再增加磷酸化試劑添加量,磷酸化程度逐漸趨于穩(wěn)定甚至有所下降,可能是大量的多聚磷酸鈉使溶液濃度增大,抑制反應(yīng)發(fā)生。

        磷酸化試劑添加量對(duì)小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響見(jiàn)表5。

        圖4 磷酸化試劑添加量對(duì)于小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響

        表5 磷酸化試劑量對(duì)小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響

        隨著磷酸化程度的加大,小麥面筋蛋白的功能性質(zhì)均有所提高,當(dāng)磷酸化試劑添加量達(dá)到25%時(shí),功能性質(zhì)達(dá)到最大,因此最佳磷酸化試劑添加量為25%。

        通過(guò)單因素試驗(yàn)可知,去酰胺小麥面筋蛋白磷酸化改性的最佳條件為反應(yīng)時(shí)間30 min,反應(yīng)pH值9,反應(yīng)溫度45℃,磷酸化試劑添加量25%。

        2.3 小麥面筋蛋白前后的紅外分析

        未改性小麥面筋蛋白的紅外光譜見(jiàn)圖5,去酰胺改性小麥面筋蛋白的紅外光譜見(jiàn)圖6,復(fù)合改性小麥面筋蛋白的紅外光譜見(jiàn)圖7。

        圖5 未改性小麥面筋蛋白的紅外光譜圖

        由圖2~圖5可知,3 301 cm-1附近的特征吸收峰為N-H的伸縮振動(dòng)吸收帶,1 657 cm-1附近的特征吸收峰為酰胺基團(tuán)上C=O鍵的伸縮振動(dòng);1 537 cm-1附近的特征吸收峰為N-H鍵的彎曲振動(dòng);1 450 cm-1附近的特征吸收峰為C-N伸縮振動(dòng)。這些均為小麥面筋蛋白紅外光譜圖的特征吸收譜[13]。由圖6可知,3 284 cm-1附近的特征吸收峰為羧基上-OH的彎曲振動(dòng),1 654 cm-1附近的特征吸收峰為羧基上C=O鍵的伸縮振動(dòng)。1 312 cm-1附近的特征吸收峰為C-O單鍵的伸縮振動(dòng)[14]。由圖5和圖6中可知,3 301 cm-1和1 657 cm-1附近吸收峰的變化說(shuō)明有部分的酰胺基團(tuán)在去酰胺改性后變成了羧基。由圖7可知,由于蛋白質(zhì)中的側(cè)鏈-OH、-NH2上連接了磷酸基團(tuán)。所以,在1 073 cm-1和1 035 cm-1處出現(xiàn)氨基酸-PO32-和氨基酸-P-O-C的明顯吸收峰[15]。同時(shí),在3 800 cm-1和2 900 cm-1處的裂分減少,可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中的-OH,-NH2因磷酸根離子替代而消失。

        圖6 去酰胺改性小麥面筋蛋白的紅外光譜圖

        圖7 復(fù)合改性小麥面筋蛋白的紅外光譜圖

        3 結(jié)論

        對(duì)小麥面筋蛋白進(jìn)行磷酸化改性的單因素試驗(yàn),得出改性的最佳條件為反應(yīng)溫度45℃,反應(yīng)pH值9,反應(yīng)時(shí)間30 min,多聚磷酸鈉添加量25%。紅外譜圖分析也驗(yàn)證了改性確實(shí)成功了。對(duì)改性前后的小麥面筋蛋白進(jìn)行功能性質(zhì)的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)去酰胺與磷酸化復(fù)合改性后的小麥面筋蛋白的功能性質(zhì)比未改性和去酰胺改性的小麥面筋蛋白的功能性質(zhì)均提高不少,這無(wú)疑是一個(gè)變廢為寶的過(guò)程,日后可將其添加到運(yùn)動(dòng)飲料中,可直接補(bǔ)充蛋白質(zhì),添加到老年人的保健品中可平衡飲食結(jié)構(gòu)等。

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