孫婷婷，侯興剛，李 靜，李德軍

（天津師范大學(xué)物理與材料科學(xué)學(xué)院，天津300387）

由于具有良好的生物相容性、與人骨接近的彈性模量、抗壓和抗拉強(qiáng)度高等優(yōu)良的物理性能，醫(yī)用鈦合金在牙科、骨科和血管支架等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2].為使醫(yī)用鈦合金獲得更好的生物相容性，其表面改性一直是研究的熱點(diǎn).目前，在醫(yī)用鈦合金表面形成TiO2納米管（TNTs）結(jié)構(gòu)是其表面改性的重要研究課題[3].與體材料相比，TiO2納米管（TNTs）具有更大的比表面積，提高了表面負(fù)載量，有利于其作為體內(nèi)藥物可控釋放的載體[4-7].為提高臨床應(yīng)用的安全性，TNTs需具備一定的抗菌性能，以抑制植入體表面的感染.因此，本研究采用具有良好抗菌性能的Ag+注入方法制備含銀TiO2納米管（Ag+-TNTs）.通過(guò)釋放的Ag+與細(xì)菌直接作用，破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抗菌目的.此外，釋放到溶液中的Ag+還會(huì)生成·OH等具有強(qiáng)氧化性的自由基.這些活性自由基通過(guò)強(qiáng)氧化作用氧化細(xì)菌體內(nèi)的輔酶A，破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，實(shí)現(xiàn)抗菌目的[7-9].為了有效結(jié)合Ag+的抗菌性能和TNTs納米結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)，本研究采用離子注入法制備Ag+-TNTs，重點(diǎn)研究注入劑量對(duì)TNTs抗菌性能的影響.同時(shí)，為了研究Ag+對(duì)TNTs表面細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，通過(guò)表征TNTs表面的親水性，分析注入對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能的影響.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品制備

1.1.1 Ag+注入

將純度高于99.7%的Ti片（1 cm×4 cm，d=2.5 mm）用細(xì)砂紙打磨，分別用丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水超聲清洗5 min，取出后置于60℃烘箱烘干備用.以Ag作為陰極，利用MEVVA源離子注入機(jī)對(duì)Ti片進(jìn)行離子注入，加速電壓為60 kV，注入基底Ti片的Ag+注入劑量分別為 5×1016、1×1017和 5×1017ions/cm2.

1.1.2 Ag+-TNTS制備

以Ag+注入后的Ti片為陽(yáng)極，相同大小的Pt片為陰極，保持兩電極相互平行，在電極間距為3 cm、電壓為50 V的直流恒壓條件下，置于電解液中.電解液由1.66 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的氫氟酸、270 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%的乙二醇和30 mL去離子水組成，進(jìn)行陽(yáng)極氧化2 h，最后將所得樣品在450℃的高溫下燒結(jié)4 h，得到Ag+注入TNTs.

1.2 樣品測(cè)試

1.2.1 樣品表征

采用日本日立公司的SU8100型掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)樣品的表面形貌進(jìn)行表征，采用D/MAX-2500型 X 線衍射儀（XRD，Cu（40 kV），20 mA）對(duì)樣品的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；利用X線光電子能譜（XPS，PHI5000VersaProbe，Ulvac-Phi，Japan）對(duì)材料的表面成分進(jìn)行分析.采用JC2000型接觸角測(cè)試儀測(cè)量水滴與Ag+-TNTs、TNTs和純Ti片表面的接觸角，表征其親水性能，每次用儀器針管滴去離子水5 μL，為減小測(cè)量誤差，每個(gè)樣品在薄膜表面的5個(gè)不同位置測(cè)量接觸角值，最后取平均值[10].

1.2.2 抗菌實(shí)驗(yàn)

①吸取大腸桿菌E.coli（革蘭氏陰性）菌液10 μL滴入4mL的LB液體培養(yǎng)基中（不含抗生素，pH=7.0），在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；②利用分光光度計(jì)測(cè)試細(xì)菌懸濁液的OD值，用磷酸緩沖溶液（PBS，pH=7）梯度稀釋上述大腸桿菌菌液，將細(xì)菌分散成單個(gè)細(xì)菌，使大腸桿菌溶液初始濃度為5×104CFU/mL，其中PBS溶液由1 000 mL的H2O溶解8.5 g的NaCl、2.2 g的Na2HPO4以及0.2 g的NaH2PO4配制而成；③將無(wú)菌純Ti片作為對(duì)照組，Ag+-TNTs和TNTs樣品作為實(shí)驗(yàn)組，標(biāo)號(hào)后放入無(wú)菌24孔板的各個(gè)孔中，將1 mL菌液用移液槍注入到孔中，將24孔板放入37℃、轉(zhuǎn)速為210 r/min的搖床中恒溫培養(yǎng)24 h，利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)得大腸桿菌菌落數(shù)，計(jì)算不同材料的抗菌效率；④在空白孔中注入1 mL菌液作為對(duì)照組，重復(fù)上述步驟，以上實(shí)驗(yàn)均在無(wú)菌條件下進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)表征與元素分析

圖1為不同Ag+注入計(jì)量樣品的SEM形貌圖.

圖1 不同Ag+注入劑量的TNTs的SEM圖Fig.1 SEM images of Ag+implanted TiO2nanotubes with different dose

由圖1（a）可以觀察到，未注入Ag+的TNTs絮狀物較多，坍塌腐蝕比較嚴(yán)重，注入Ag+的TNTs比較整齊，說(shuō)明Ag+注入可以有效緩解坍塌現(xiàn)象.隨著Ag+注入劑量的增加，TNTs的形貌更加整齊，結(jié)構(gòu)更加有序，致密性增加.當(dāng)Ag+注入劑量為5×1017ions/cm2時(shí)，納米管間毫無(wú)粘連且朝向一致有序，納米管和基底間結(jié)合牢固不脫落.相比未注入Ag+的情況，Ag+-TNTs具有更強(qiáng)的吸附能力和更大的比表面積，有利于提高TNTs的表面負(fù)載量[11-12].TNTs孔隙率的提高有利于表面吸附更多的水分子和氧，從而生成更多的羥基，提高TNTs表面的親水性.

圖2為不同Ag+注入劑量下TNTs陣列樣品的XRD圖譜.由圖2可以看出，TNTs經(jīng)過(guò)高溫退火后出現(xiàn)銳鈦礦相衍射峰，TNTs和所有Ag+-TNTs均在2θ=25.31°處出現(xiàn)了TiO2銳鈦礦相的衍射峰，對(duì)應(yīng)（101）晶面，是TiO2銳鈦礦相熱力學(xué)上最穩(wěn)定的晶面[12-13].此外，TiO2納米管還出現(xiàn)了TiO2銳鈦礦相的（103）和（200）晶面，分別對(duì)應(yīng) 36.95°和 48.04°處.在 Ag+-TNTs中，未發(fā)現(xiàn)Ag的衍射峰，即沒(méi)有產(chǎn)生新相.但隨著Ag-注入劑量的增加，銳鈦礦相（101）晶面的峰值逐漸減弱，各衍射峰變得尖銳，說(shuō)明Ag+注入劑量增大有利于TNTs結(jié)晶性的增強(qiáng).

圖2 不同Ag+注入劑量TNTs的XRD圖Fig.2 XRD patterns of Ag+implanted TiO2nanotubes with different dose

Ag+注入劑量為1×1017ions/cm2的Ag+-TNTS的Ag 3d的XPS圖譜如圖3所示.

圖3 Ag+注入 TNTs的 XPS圖Fig.3 Ag 3d XPS spectra of Ag+implanted TiO2nanotubes

由圖3可以看出，Ag 3d5/2結(jié)合能的峰值出現(xiàn)在367.8 eV處，經(jīng)高斯擬合后，在結(jié)合能為366.8、367.8和369eV處出現(xiàn)了3個(gè)峰值，分別對(duì)應(yīng)Ag2+、Ag+、Ag0[14-15]，且Ag+峰強(qiáng)最強(qiáng)，表明注入的Ag主要以Ag+形式存在.Ag+是Ag實(shí)現(xiàn)抗菌功能的主要釋放形式，因此離子注入后，樣品表面存在大量Ag+有利于提高Ag+-TNTS的抗菌能力.

2.2 親水性能

圖4為自然光照射下測(cè)量不同Ag+注入劑量TNTs表面接觸角時(shí)水滴的鋪展圖.由圖4可以看出，樣品的接觸角分別為 37.6 °、33.7 °、28.2 °、13.2 °和 11.0 °，水滴在TNTs表面的接觸角小于Ti片，說(shuō)明納米管的親水性優(yōu)于純Ti表面的氧化層.原因主要有2點(diǎn)：一方面是TiO2納米管有較高的活性比表面和大量的表面缺陷，表面積的增加提高了水分子與材料的接觸機(jī)會(huì)；另一方面純Ti片經(jīng)陽(yáng)極氧化生成TiO2納米管后，也產(chǎn)成了少量的親水性基團(tuán)，此外，陽(yáng)極氧化的表面處理方法可以提高純Ti的表面自由能.而隨著Ag+注入后，水滴在TNTs表面的接觸角明顯減小，且隨著Ag+注入劑量的增加，接觸角減小.當(dāng)Ag+注入劑量為5×1017ions/cm2時(shí)，納米管的親水角減小到最小.這表明適量注入Ag+有助于在TNTs表面產(chǎn)生肖特基勢(shì)壘，促進(jìn)光生載流子的分離，從而使Ag+-TNTs具有極高的親水性能[16-17].研究表明，生物材料表面親水性的提高有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此Ag+注入有利于細(xì)胞在TNTs表面的生長(zhǎng).此外，含銀材料的抗菌模式之一為直接接觸抗菌，因此Ag+注入TNTs表面也有利于細(xì)菌的吸附，相應(yīng)提高TNTs的抗菌性能.

圖4 樣品表面水滴圖像Fig.4 Images of water droplet on the surface of the samples

2.3 抗菌性能

不同Ag+注入劑量的TNTs與大腸桿菌作用后的菌落照片如圖5所示.由圖5可以看出，空白組樣品和未注Ag+的TNTs表面存在大量菌落分布，注入Ag+的TNTs樣品的菌落存活量均有明顯減少，說(shuō)明注入Ag+的TNTs均具有一定的抗菌效果.從圖5中可以清晰地看出，隨著Ag+注入劑量的增大，Ag+-TNTs的抗菌能力有所增強(qiáng)，均明顯優(yōu)于TNTs.而當(dāng)Ag+注入劑量為5×1017ions/cm2時(shí)，Ag+-TNTs表面幾乎沒(méi)有細(xì)菌菌落，說(shuō)明此時(shí)納米管的抗菌效果最好.

用體視顯微鏡觀察并用數(shù)碼相機(jī)記錄注Ag+與未注入Ag+樣品的菌落數(shù)，按下式計(jì)算樣品的抗菌率.

式（1）中：A和B對(duì)應(yīng)相同面積內(nèi)，自然生長(zhǎng)下培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)和不同Ag+注入劑量Ag+-TNTs與細(xì)菌作用后培養(yǎng)皿中的菌落數(shù).

圖5 不同Ag+注入劑量的TNTS對(duì)大腸桿菌存活率影響Fig.5 E.coli survival of Ag+implanted TiO2nanotubes with different dose

統(tǒng)計(jì)各樣品培養(yǎng)皿中固定面積的菌落數(shù)，通過(guò)式（1）計(jì)算得到抗菌率分別為2.7%、7.8%、50.6%、86.0%和94.9%.通過(guò)計(jì)算抗菌率可以直觀看出，Ag+-TNTs樣品具有明顯的抗菌效果，且抗菌效率隨著Ag+注入劑量的增大而增大.由此推斷當(dāng)注入劑量高于5×1017ions/cm2時(shí)，Ag+-TNTs對(duì)大腸桿菌的抗菌率接近100%.光照條件下，TiO2材料能生成大量氧化能力很強(qiáng)的羥基自由基，因此TiO2材料具備抗菌性.本研究中抗菌實(shí)驗(yàn)在避光條件下進(jìn)行，因此TNTs只表現(xiàn)出了微弱的抗菌性，Ag+-TNTs的抗菌性幾乎完全由注入的Ag+產(chǎn)生.TNTs中Ag以離子形式存在，且管狀結(jié)構(gòu)增加了其與菌液的接觸面積，有利于更多的Ag+析出到菌液中.析出的Ag+與細(xì)菌中蛋白酶上的巰基（—SH）結(jié)合，使蛋白酶失去活性，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[18-20].由以上分析可知，Ag+-TNTs抗菌效率與菌液中Ag+濃度有關(guān)，濃度越高抗菌效率越高，因此Ag+注入劑量最高的TNTs表現(xiàn)出了最高的抗菌性.

3 結(jié)論

通過(guò)Ag+注入純Ti片基底和陽(yáng)極氧化法制備一系列不同注入劑量的Ag+-TNTs.利用SEM、XRD和XPS對(duì)TNTs和Ag+-TNTs的表面形貌、微觀結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行表征，利用抗菌率和水接觸角分別表征TNTs和Ag+-TNTs的殺菌性能和親水性能.研究結(jié)果表明：

（1）離子注入摻雜技術(shù)可以明顯改變TNTs的表面結(jié)構(gòu)，改善TNTs的表面形貌和結(jié)晶性.

（2）與TNTs相比，不同Ag+注入劑量Ag+-TNTs的親水性均得到改善，且隨著Ag+注入劑量的增加，親水性不斷提高.材料表面的親水性越高，表面自由能就越低，可以抑制微生物粘附，防止形成微生物膜.

（3）TNTs對(duì)大腸桿菌幾乎沒(méi)有抗菌作用，而注入Ag+后，Ag+-TNTs表現(xiàn)出優(yōu)良的抗大腸桿菌能力，且隨著Ag+注入劑量的增大，抗菌效果越明顯，說(shuō)明Ag+注入可以有效提高TNTs的抗菌性能.

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