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(1. 山東理工大學(xué) 計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 山東 淄博 255049； 2. 山東大學(xué) 山東省軟件工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濟(jì)南 250000)

天然無序蛋白質(zhì)是一類柔性極強(qiáng)的蛋白質(zhì)，它們在未綁定到其他分子時，處于不折疊的松散狀態(tài)卻具有正常的生物學(xué)功能，不僅廣泛參與各種重要的生理與病理過程， 而且與神經(jīng)退行性疾病和癌癥的關(guān)系非常密切[1-2]。天然無序蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)普遍存在，并且生命形式越高級其含量越多[1-2]，特別是在人類細(xì)胞中，大約30%～50%的蛋白質(zhì)完全無序或包含顯著無序片段[3]。雖然無序蛋白質(zhì)在單獨(dú)存在狀態(tài)下無折疊，但是當(dāng)綁定到其分子伴侶上時，其中的某些片段會發(fā)生從無折疊到折疊的狀態(tài)改變，通常把這些能改變狀態(tài)的片段稱為分子識別特征(molecular recognition features，MoRF)[4]，也稱功能模體。同一個MoRF可以與多個不同的分子對象綁定而呈現(xiàn)不同的二級結(jié)構(gòu)折疊狀態(tài)。MoRF很容易形成蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的“集線器”[5]，是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵點(diǎn)，因此，識別MoRF在無序蛋白質(zhì)序列中的位置，對理解蛋白質(zhì)的功能，研究蛋白質(zhì)折疊機(jī)制和相關(guān)疾病的致病機(jī)理及尋找藥物靶點(diǎn)至關(guān)重要。

物理實(shí)驗(yàn)方法識別無序蛋白質(zhì)功能模體具有難度大、 成本高、 耗時長(無序片段在X射線晶體衍射圖上電子密度缺失)的缺陷， 而計(jì)算機(jī)輔助方法能極大地降低成本和縮短耗費(fèi)時間， 并且為在大數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析提供可能， 是必不可少的方法。 天然無序蛋白質(zhì)和MoRF沒有固定的折疊結(jié)構(gòu)， 能用的結(jié)構(gòu)特征信息有限， 因此， 基于序列特征的預(yù)測方法受到了廣泛關(guān)注。 目前人們提出一些基于序列特征來預(yù)測無序蛋白質(zhì)MoRF序列位置的方法， 其中， 代表性的方法有MoRFpred[6]、 ANCHOR[7]、 MFSPSSMpred[8]、 Retro-MoRFs[9]、 MoRFCHiB[10]和MoRFPred-plus[11]。這些方法將從其他預(yù)測工具得到的大量結(jié)果作為輸入特征，例如，預(yù)測的殘基無序傾向概率、二級結(jié)構(gòu)特征、溶劑可及表面面積和二面轉(zhuǎn)角等。大量采用預(yù)測的特征值進(jìn)行串聯(lián)后再次作為輸入，容易造成特征空間的高維稀疏而導(dǎo)致“過擬合”問題，并且極大地增加了算法的復(fù)雜度。另外，傳統(tǒng)算法將特征抽取和機(jī)器學(xué)習(xí)訓(xùn)練作為2個獨(dú)立的過程進(jìn)行，先采用各種統(tǒng)計(jì)分析方法提取特征并人工進(jìn)行預(yù)處理，再進(jìn)行二次編碼來生成特征向量作為機(jī)器學(xué)習(xí)的輸入，然后進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練，沒有考慮特征抽取和機(jī)器學(xué)習(xí)過程之間存在著潛在的不匹配效應(yīng),而且人工特征工程也容易導(dǎo)致特征抽取的不全面，因此，有必要提出更加簡單、高效的算法來改進(jìn)無序蛋白質(zhì)功能模體的預(yù)測。

先前的研究[7,12]表明，無序蛋白質(zhì)功能模體具有特定的序列保守性模式，它是由高度保守殘基夾雜著高度可變的殘基構(gòu)成的。高度保守是為了維護(hù)特定的功能，而高度可變是為了維護(hù)無序結(jié)構(gòu)的靈活性。在結(jié)合分子伴侶時，并不是所有殘基貢獻(xiàn)都一樣，只有一些特定的殘基模式在分子識別中有貢獻(xiàn)，因此，功能模體在蛋白質(zhì)序列的特征表達(dá)中具有特定的模式。

目前，隨著人工智能熱潮的到來，深度學(xué)習(xí)受到了高度關(guān)注，而深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(deep convolutional neural networks, DCNN)被視為深度學(xué)習(xí)的支柱。DCNN最初是被設(shè)計(jì)用來處理圖像像素矩陣中的空間局部關(guān)聯(lián)性[13]。它直接以原始圖像作為輸入，避開傳統(tǒng)識別算法中復(fù)雜的特征提取和數(shù)據(jù)重建過程，隱式地從訓(xùn)練數(shù)據(jù)中自行抽取特征進(jìn)行學(xué)習(xí)。DCNN取得成功的關(guān)鍵是卷積算子能夠充分利用圖像像素矩陣中密集表示的數(shù)據(jù)的空間局部相關(guān)性[13]。因?yàn)檫@種局部相關(guān)性不是圖像數(shù)據(jù)所特有的，任何能表示成矩陣形式的其他類型的數(shù)據(jù)也具有這類屬性，所以DCNN在自然語言、聲音、視頻等多個領(lǐng)域的應(yīng)用取得了巨大成功。另外，DCNN不像傳統(tǒng)算法那樣把特征提取和模型學(xué)習(xí)作為2個獨(dú)立的步驟進(jìn)行，而是交織在一起同時進(jìn)行，這樣可以減少特征提取和模型學(xué)習(xí)之間潛在的不匹配效應(yīng)[13]。

本文中采用類似于圖像的表示方法(像素矩陣)來表示蛋白質(zhì)序列(特征矩陣)，序列中的功能模體的模式信息也必然包含在該序列所對應(yīng)的特征矩陣中，所以DCNN也適用于蛋白質(zhì)中功能模體的序列模式識別問題?；诖吮疚闹刑岢鲆环N簡單的序列表示方法來描述蛋白質(zhì)的序列信息，并采用DCNN構(gòu)建模型進(jìn)行無序蛋白質(zhì)功能模體MoRF的預(yù)測。

1　數(shù)據(jù)和方法

1.1　數(shù)據(jù)集

本文中所使用的數(shù)據(jù)集分為3個部分，即訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和測試集，均來自于文獻(xiàn)[6]中所使用的數(shù)據(jù)集。其中訓(xùn)練集取自于421條蛋白質(zhì)多肽鏈,包含了5 396個正樣本(MoRF殘基) 和240 588個負(fù)樣本(非MoRF殘基)。為了解決正、負(fù)樣本的嚴(yán)重不平衡問題，從負(fù)樣本中隨機(jī)抽取了與正樣本等量的樣本數(shù)與正樣本合并到一起組成訓(xùn)練集。驗(yàn)證集由419條包含MoRF的蛋白質(zhì)多肽鏈構(gòu)成，測試集由45條包含MoRF的蛋白質(zhì)多肽鏈構(gòu)成。驗(yàn)證集、測試集與訓(xùn)練集的序列相似度均小于30%。上述數(shù)據(jù)集的統(tǒng)計(jì)見表1。

表1　數(shù)據(jù)集的統(tǒng)計(jì)

1.2　蛋白質(zhì)序列特征表示

本文中使用了2類特征來表示蛋白質(zhì)序列，即位置性特異性打分矩陣(position specific scoring matrix，PSSM)和氨基酸特征系數(shù)。

1)PSSM。本文中使用PSI-BLAST (position specific iterative basic local alignment search tool)命令[14]，設(shè)置迭代次數(shù)為3，比對美國國家生物技術(shù)信息中心的非冗余序列數(shù)據(jù)庫來生成PSSM文件。每條長度為l的蛋白質(zhì)肽鏈可得到一個l×20型的矩陣(l為蛋白質(zhì)序列的長度)。該矩陣主要用來代表序列中氨基酸的保守性特征，其元素值分布在[-16,16]之間，元素?cái)?shù)值越大，表示保守性越強(qiáng)。

2)氨基酸特征系數(shù)。本文中使用了3類特征系數(shù)來表示氨基酸特征(圖1)，分別來自文獻(xiàn)[15]中的10種木寺系數(shù)(k1—k10)、文獻(xiàn)[16]中的5種特征系數(shù)(f1—f5)和文獻(xiàn)[17]中的7種特征系數(shù)(p1—p7)。這些特征系數(shù)在相關(guān)文獻(xiàn)里被認(rèn)為是能比較豐富地表達(dá)氨基酸的各種理化特征信息和微觀結(jié)構(gòu)特征信息。這樣，每條蛋白質(zhì)序列可表示為一個l×(10+5+7)型，即l×22型的矩陣。

黃色背景的k1—k10、綠色背景的f1—f5和藍(lán)色背景的p1—p7分別代表了不同類的特征系數(shù)，每類分別包含了3×20個、5×20個和7×20個系數(shù)常量。圖1　3類氨基酸的特征系數(shù)

1.3　蛋白質(zhì)序列的編碼方式

用PSSM及3組氨基酸特征系數(shù)矩陣橫向連接到一起來表示蛋白質(zhì)序列特征，每條長度為l的蛋白質(zhì)序列對應(yīng)到一個l×(20+10+5+7)型，即l×42型的矩陣。采用滑動窗口切分該矩陣，為每個殘基產(chǎn)生一個特征矩陣作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的輸入。無序蛋白質(zhì)MoRF片段的長度一般分布在5～25個殘基之間，為了讓每個殘基可能對應(yīng)的MoRF片段的信息都完整地包含在該滑動窗口內(nèi)，本文中采用長度為51的滑動窗口(每個殘基兩側(cè)各取25個殘基)來切分序列所對應(yīng)的特征矩陣。通過這種編碼方式，每個殘基的特征信息即被表示成一個51×42型的矩陣。

1.4　方法的流程圖

本算法的流程圖如圖2所示。 首先， 由蛋白質(zhì)序列得到PSSM， 并計(jì)算序列對應(yīng)的3類特征系數(shù)(k1—k10、f1—f7和p1—p5)。 用上述PSSM和各種特征系數(shù)橫向連接來表示蛋白質(zhì)序列， 使每條長度為l的蛋白質(zhì)序列對應(yīng)于一個l×42型的矩陣； 然后， 通過滑動窗口提取每個殘基對應(yīng)的特征矩陣塊作為DCNN模型的輸入； 最后， 將DCNN模型的輸出概率值進(jìn)一步通過平滑處理， 產(chǎn)生最終的預(yù)測結(jié)果。

1.5　深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)

本文中采用的DCNN結(jié)構(gòu)如圖3所示，3個卷積層(卷積核大小為3×3)、3個丟失層(丟失率為0.2)和3個下采樣層(窗口大小為2×2)分別交織在一起，最后再接上2個全連接層，并在全連接層中間也插入1個丟失層(丟失率為0.2)。除了輸出層的激活函數(shù)為Sigmoid， 用來產(chǎn)生預(yù)測概率值外， 其他各層的激活函數(shù)均為Relu，模型訓(xùn)練時損失函數(shù)為Binary_crossentropy，優(yōu)化函數(shù)為RMSProp。

1.6　評價(jià)指標(biāo)

本研究屬于二分類問題，即判斷某個氨基酸殘基是否屬于無序蛋白質(zhì)的MoRF片段。感受性曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)及曲線下的面積(area under curve, AUC)值被用來作為算法的評價(jià)指標(biāo)。AUC值越大，即ROC下的面積值越大，說明該分類器的性能越好。在ROC圖中，每個點(diǎn)的橫坐標(biāo)為假陽性率(FPR)，代表將負(fù)樣本錯分為正樣本的概率；縱坐標(biāo)為真陽性率(TPR)，代表將正樣本分對的概率。另外， 正確指數(shù)又稱約登(Youden)指數(shù)，也被用來作為評價(jià)指標(biāo)之一。該指數(shù)為正樣本分對的概率與負(fù)樣本分對的概率之和減去1，表示分類器對樣本預(yù)測正確的總能力，指數(shù)越大，性能越好。

2　結(jié)果與分析

2.1　平均化處理滑動窗口的優(yōu)化

因?yàn)闊o序蛋白中的功能模體是一個連續(xù)的序列片段而不是單個的氨基酸， 所以本文中采用滑動窗口對DCNN模型的輸出概率值進(jìn)行平滑的優(yōu)化處理， 即對每個殘基取包含其兩側(cè)一定長度內(nèi)的殘基預(yù)測概率的平均值作為該中心殘基的最終預(yù)測結(jié)果。 為了優(yōu)化平均化滑動窗口的大小， 本文中在驗(yàn)證集上進(jìn)行了分析比較。該算法根據(jù)不同滑動窗口

conv2d、max_pooling2d、dense、dropout和activation分別表示對應(yīng)的卷積層、下采樣層、全連接層、丟失層和激活層；input和output表示各層網(wǎng)絡(luò)對應(yīng)的輸入和輸出參數(shù)。圖3　本文中使用的深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)圖

大小所得到的ROC曲線如圖4所示。當(dāng)窗口長度大于9后，算法性能趨于穩(wěn)定，因此，本文中選擇最佳的滑動窗口長度13來進(jìn)行結(jié)果的優(yōu)化。

圖4　根據(jù)不同平均化滑動窗口大小所得到的感受性曲線

2.2　基于不同特征的方法的性能比較

在驗(yàn)證集上， 本文中對使用不同特征表示蛋白質(zhì)序列的方法的性能進(jìn)行了比較。 主要對比了以下4種方法： 1)打分矩陣方法僅使用了PSSM來表示蛋白質(zhì)序列特征； 2)特征系數(shù)方法僅使用了3類氨基酸特征系數(shù)來表示蛋白質(zhì)序列特征； 3)打分矩陣-特征系數(shù)方法同時使用了PSSM和3類氨基酸特征系數(shù)來表示蛋白質(zhì)序列特征，但沒有采用最后的平滑處理來優(yōu)化結(jié)果；4)本文中提出的方法。上述4種方法在驗(yàn)證集上進(jìn)行測試得到的ROC曲線如圖5所示，本文中提出的方法AUC值達(dá)到0.708，優(yōu)于其他方法的性能。

圖5　4種基于不同特征的方法在驗(yàn)證集上的感受性曲線

2.3　與其他方法的比較

目前已有的方法中，Retro-MoRFs[9]、MoRFCHiB[10]和MoRFPred-plus[11]的性能主要依賴于組合多個分類器的預(yù)測結(jié)果，它們的精確度在很大程度上是“以量取勝”，而本文中提出的方法是基于單個機(jī)器學(xué)習(xí)模型的，因此，只與3個有代表性的單模型方法進(jìn)行了比較，即MoRFpred[6]、ANCHOR[7]和MFSPSSMpred[8]，這些方法也經(jīng)常在其他文獻(xiàn)中作為比較對象。經(jīng)過在測試集上進(jìn)行測試，各方法的ROC曲線圖如圖6所示，詳細(xì)的正確指數(shù)、TPR、FPR和AUC值列于表2中。從圖6和表2中可以看出，本文中提出的方法在測試集上取得最好的性能，即正確指數(shù)值達(dá)到0.444，AUC值達(dá)到0.760。

圖6　不同方法在測試集上的感受性曲線

方法名稱正確指數(shù)真陽性率假陽性率線下面積值文獻(xiàn)[6]中的方法0.1920.2360.0450.697文獻(xiàn)[7]中的方法0.1980.4330.2360.638文獻(xiàn)[8]中的方法0.3700.5460.1760.706本文中提出的方法0.4440.7320.2880.760

3　結(jié)語

本文中利用一種深度學(xué)習(xí)方法來預(yù)測天然無序蛋白質(zhì)中的功能模體在序列中的位置。采用位置特異性打分矩陣和3類氨基酸特征系數(shù)來描述蛋白質(zhì)序列信息，將每條序列編碼成類似于圖像像素矩陣的二維數(shù)值矩陣形式，并用DCNN來搭建模型進(jìn)行預(yù)測。 另外， 本文中把無序蛋白質(zhì)中的功能模體預(yù)測作為一個片段識別來對待， 而不是像傳統(tǒng)方法那樣作為單個的殘基分類， 所以在DCNN的輸出上加了一個段平均化的平滑處理步驟來進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)果。 在相同數(shù)據(jù)集上進(jìn)行測試和比較， 結(jié)果表明，本文中提出的方法顯著優(yōu)于其他方法， AUC值和正確指數(shù)值均大于其他方法的，說明本算法能有效地識別功能模體在無序蛋白質(zhì)序列中的隱藏信息模式。本方法也適用于其他聚集型蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)的預(yù)測。

馮曉英等學(xué)者研究的結(jié)論說明：“經(jīng)過20年的發(fā)展，混合式教學(xué)的實(shí)踐與研究已經(jīng)漸趨成熟；混合式教學(xué)被普遍看好，被認(rèn)為是未來教學(xué)的主要形式；政府和教育機(jī)構(gòu)也對混合式教學(xué)給予越來越多的戰(zhàn)略和政策支持?！本唧w來講：