李陽，吳非，蔡冬波，占楊楊，李俊輝，陳曉斌，陳慧超，陳守文，馬昕

1湖北大學 生命科學學院 生物資源綠色轉化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省環(huán)境微生物工程技術研究中心，湖北 武漢430062

2 綠康生化股份有限公司，福建 浦城 353400

桿菌肽是一種主要由枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌產生的廣譜性抗生素，由11種氨基酸殘基組成，包括 Orn、D-Phe、His、D-Asp、Asn、Lys、D-Glu、Cys、Leu、Ile和 Val[1-4]。作為一種廣譜性抗生素，桿菌肽能通過抑制細菌細胞壁的合成從而抑制革蘭氏陽性細菌和部分革蘭氏陰性菌[2,5]，另外桿菌肽幾乎不會在動物的腸道內被吸收，因此被廣泛應用于飼料添加[6-7]。

桿菌肽在動物飼料添加方面具有巨大的市場前景，但是其合成效率低，嚴重影響了桿菌肽的產量和市場開發(fā)。目前，桿菌肽的高產主要是通過高產菌株的選育和發(fā)酵條件的優(yōu)化來實現(xiàn)的[8-9]，而高產菌株的選育主要是通過傳統(tǒng)的誘變方法，如紫外誘變、化學誘變等，但這些手段提高桿菌肽的產量有限，并且高產性狀極不穩(wěn)定，容易發(fā)生回復突變[10]。因此，通過代謝工程手段選育桿菌肽高產菌株具有重要的理論意義和應用價值[11]。之前的研究表明，提高前體物質的供應可以提高次級代謝產物的產量，因此通過代謝工程手段提高桿菌肽的前體氨基酸的供應，有望提高桿菌肽的產量[12-13]。

本實驗室前期通過氨基酸添加實驗發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加桿菌肽合成前體氨基酸Cys、Ile、Leu、Lys和Glu等均可以提高桿菌肽的產量，其中Ile的添加可以顯著提高桿菌肽的產量[6]。因此，通過代謝工程手段提高前體氨基酸的供給水平可能是提高桿菌肽生產水平的有效策略[13-15]。轉運蛋白是影響細胞內氨基酸供應的重要因素，其可以通過影響前體氨基酸胞內胞外的分布從而影響目標產物的高產[16-18]。枯草芽胞桿菌中，BcaP (YhdG)負責包括支鏈氨基酸在內的多種氨基酸的轉運，并且是Ile最有效的轉運蛋白，負責Ile的攝入[19-21]。桿菌肽發(fā)酵原料主要為豆粕等蛋白質資源，菌體如何高效利用胞外氨基酸是提高菌體高效合成桿菌肽的關鍵因素之一。本研究重點圍繞轉運蛋白 YhdG開展研究，通過研究不同表達水平的氨基酸轉運蛋白YhdG對桿菌肽發(fā)酵效價的影響，從而構建桿菌肽高產菌株，并為構建高效利用豆粕資源的桿菌肽重組菌株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究作用的菌株質粒見表 1，其中出發(fā)菌株地衣芽胞桿菌DW2由福建浦城綠康生化股份有限公司提供，菌種保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏號：CCTCC M2011344。本研究所使用的引物見表2。

表1 本研究所用的菌株和質粒Table 1 The strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用的引物Table 2 The primers used in this study

1.2 主要試劑

限制性內切酶 (EcoRⅠ、XbaⅠ、SacⅠ)、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、溶菌酶、DNA分子量標準 (如 DL15000 Marker，DL5000 Marker，DL2000 Marker) 購自TaKaRa公司；Fastpfu DNA酶購自北京全式金生物技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自上海賽百盛公司；質粒小提試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；引物合成及序列測定由北京澳科公司完成；瓊脂糖為 Biowest產品；D-甘露醇、D-山梨醇均為武漢華順生物技術公司進口分裝產品；高效液相色譜使用的甲醇及乙腈為色譜純；酵母抽提物、胰蛋白胨購自英國Oxoid公司；氯化鈉、硫酸銨等試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；豆粕、玉米淀粉、輕質碳酸鈣由福建浦城綠康生化有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母抽提物 0.5%，胰蛋白胨1%，NaCl 1%，瓊脂粉2%，pH 7.2。

LB液體培養(yǎng)基：酵母抽提物 0.5%，胰蛋白胨1%，NaCl 1%，pH 7.2。

桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕 10%，玉米淀粉4.5%，輕鈣0.6%，硫酸銨0.1%，pH 7.0。

1.4 工程菌的構建

1.4.1 轉運蛋白 YhdG游離強化表達工程菌的構建

游離表達工程菌DW2/pHY-yhdG的構建步驟如下：首先以枯草芽胞桿菌168基因組為模板擴增P43啟動子，以地衣芽胞桿菌DW2基因組DNA為模板擴增氨基酸轉運蛋白基因yhdG和淀粉酶基因amyL終止子TamyL，通過Splicing Overlap Extension (SOE)-PCR (SOE-PCR) 連接成目的片段，然后通過限制性內切酶EocRⅠ/XbaⅠ將目的片段插入游離表達載體 pHY300PLK中，構成游離表達載體pHY-yhdG，最后將重組載體電轉化至地衣芽胞桿菌DW2中，獲得基因yhdG游離表達工程菌DW2/pHY-yhdG。

1.4.2 轉運蛋白YhdG缺失工程菌的構建

轉運蛋白YhdG缺失工程菌的構建是依據(jù)同源重組的原理，通過溫敏性穿梭載體T2(2)-ori實現(xiàn)的[22-23]，具體步驟如下：以地衣芽胞桿菌DW2基因組DNA為模板，擴增出轉運蛋白基因yhdG的上下游同源臂，PCR產物回收，通過SOE-PCR將上下游連接到一起，并將連接到一起的片段通過SacⅠ和XbaⅠ雙酶切插入溫敏型穿梭質粒T2(2)-ori中，獲得敲除載體 T2-yhdG。將敲除載體T2-yhdG電轉化到地衣芽胞桿菌DW2中，然后挑取陽性克隆子，加入到含20 μg/mL的卡那青霉素，于 180 r/min、45 ℃的條件下傳代培養(yǎng)數(shù)代，直至發(fā)生單交換。最后將成功發(fā)生單交換的陽性克隆子接到不含抗性的LB中，于180 r/min、37 ℃的條件下傳代培養(yǎng)數(shù)代，直至發(fā)生雙交換。通過PCR驗證和DNA測序分析，獲得yhdG缺失工程菌DW2△yhdG。

1.5 發(fā)酵方法

菌種活化：挑取甘油管保藏的地衣芽胞桿菌菌種，于含有相應抗性或無抗性的 LB平板上稀釋涂布，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落再在相應的LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h。

種子培養(yǎng)：從 LB固體培養(yǎng)基上挑取單菌落接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基 (250 mL搖瓶)，230 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng) 8–10 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基用 250 mL三角瓶裝液量20 mL，接種量5%，轉速230 r/min，37 ℃培養(yǎng)，發(fā)酵時長為48 h。每株發(fā)酵菌株至少設置3個搖瓶重復。

1.6 桿菌肽效價測定

本實驗桿菌肽效價采用高效液相色譜(HPLC)方法測量，使用Agilent 1260液相色譜儀檢測[6-7]。

色譜柱：Eclipse Plus C18 column (4.6 mm ×150 mm, 3.5 μm)。

流動相：A∶B＝35∶65 (A相：100 mL磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0) 中加入300 mL蒸餾水；B相：520 mL甲醇與40 mL乙腈混合均勻，V/V)，流速：1.0 mL/min，柱溫 30 ℃；紫外檢測器波長：254 nm；進樣量20 μL。

1.7 氨基酸檢測方法

樣品前處理方法如下。胞外樣品：將發(fā)酵液置于2 mL離心管內，12 000 r/min離心10 min，取上清液保存于4 ℃冰箱；胞內樣品：取15 mL發(fā)酵液，2 000 r/min、4 ℃離心5 min。取出8 mL上清于 20 mL離心管中，快速加入 0 ℃預冷的2.5%氯化鈉 (W/V) 溶液 10 mL，迅速混勻后，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，去上清。剩余細胞團用2.5%碳酸銨(W/V，4 ℃)溶液洗滌2次，加入3 mL 80%甲醇 (V/V) 抽提5 min，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集上清，凍干，4 ℃保存。

樣品衍生化方法：胞內凍干樣品加600 μL蒸餾水溶解，從中取出 500 μL，胞外樣品直接取500 μL，加入10 μL 7 mol/L氫氧化鈉溶液使pH呈堿性，再加 500 μL無水乙醇與吡啶的混合液(無水乙醇∶吡啶=4∶1)，輕輕振蕩均勻。加100 μL氯甲酸乙酯(ECF)，超聲 1 min。再加 100 μL ECF，超聲 1 min。加 500 μL 含 1% ECF的氯仿和 200 μL飽和碳酸氫鈉，振蕩1 min，加40 μL內標溶液后移至2 mL離心管，靜置5 min，3 000 r/min離心5 min。取下層至預先裝有無水硫酸鈉粉末的1.5 mL離心管中。3 000 r/min離心5 min，將上清液用移液器轉入氣相瓶中，待檢測。

氨基酸用氣相色譜(GC)方法測量，使用Agilent 7890A氣相色譜儀檢測[6]。

色譜柱：Agilent HP-5 column (30 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣為氮氣，柱流速：1.5 mL/min；樣品進樣量為 1 μL，不分流進樣；進樣口溫度為280 ℃；柱溫程序：起始溫度70 ℃，保持5 min，以10 ℃ /min速度升溫至280 ℃，保持5 min，全過程 31 min；檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度280 ℃。載氣流量：30 mL/min，氫氣流量：30 mL/min，空氣流量：300 mL/min。

1.8 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復3個平行，采用Origin9.0進行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析；采用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，其中顯著性分析選用Duncan多范圍檢驗法。

2 結果與分析

2.1 外源支鏈氨基酸添加對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價的影響

首先研究了在桿菌肽發(fā)酵的不同時間點添加支鏈氨基酸對桿菌肽效價的影響。選取的時間點為0、6、12、18、24 h，支鏈氨基酸的添加濃度為0.08 g/L。桿菌肽發(fā)酵結果表明，分別在18 h時添加Ile和在24 h添加Leu時桿菌肽的效價最高 (圖 1A 和圖 2A)，相比于對照組分別提高了16%和6%。而添加Val對桿菌肽的效價基本沒有影響 (圖 3)。隨后，研究了添加不同濃度的 Ile和Leu對桿菌肽效價的影響。添加濃度為0.04、0.08、0.12 g/L，添加時間分別為18 h和24 h。發(fā)酵結果表明，當Ile添加濃度為0.08 g/L時，桿菌肽的效價最高，達到900.7 U/mL，相比于對照組提高了17% (圖1 B)；當Leu添加濃度為0.04 g/L時，桿菌肽的效價最高，達到871.6 U/mL，相比于對照組提高了7% (圖2 B)。說明Ile和Leu的添加可以提高桿菌肽效價，其中Ile的添加效果較為明顯。

2.2 不同表達水平轉運蛋白YhdG對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價的影響

上述支鏈氨基酸添加實驗結果表明，提高Ile和 Leu的供給可以提高桿菌肽的效價，其中 Ile的添加可以顯著提高桿菌肽效價。轉運蛋白是影響胞內氨基酸供應的重要因素，枯草芽胞桿菌中支鏈氨基酸轉運蛋白YhdG負責向細胞內轉運包括支鏈氨基酸在內的多種氨基酸，并且被認為是最有效的 Ile攝取轉運蛋白[19]。因此，我們?yōu)榱颂骄哭D運蛋白YhdG對桿菌肽發(fā)酵效價的影響，分別構建了yhdG游離強化表達工程菌 DW2/pHY-yhdG和yhdG缺失工程菌DW2△yhdG。隨后進行桿菌肽發(fā)酵，發(fā)酵結果如圖4所示，轉運蛋白YhdG缺失后可以提高桿菌肽效價，DW2△yhdG桿菌肽效價達到917.35 U/mL，與原始菌DW2相比提高了11%。強化表達YhdG后，桿菌肽效價有所下降，相比于對照菌株DW2/pHY300降低了25%。上述結果表明，yhdG的缺失有利于桿菌肽的合成，這與我們預期的結果相反。

圖1 外源Ile添加對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價的影響 (A：不同時間點添加0.08 g/L Ile對桿菌肽發(fā)酵效價影響；B：18 h添加不同濃度的Ile對桿菌肽發(fā)酵效價影響)Fig. 1 Effects of Ile addition on the bacitracin production. (A) The effects of 0.08 g/L Ile addition at different time on bacitracin production. (B) The effects of different concentrations of Ile addition at 18 h on bacitracin production. The different letters indicated the significant differences of bacitracin titers when Isoleucine addition (P<0.05).

圖2 外源Leu添加對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價的影響 (A：不同時間點添加0.08 g/L Leu對桿菌肽發(fā)酵效價影響；B：24 h添加不同濃度的Leu對桿菌肽發(fā)酵效價影響)Fig. 2 Effects of Leu addition on the bacitracin production. (A) The effects of 0.08 g/L Leu addition at different time on bacitracin production. (B) The effects of different concentrations of Leu addition at 24 h on bacitracin production.The different letters indicated the significant differences of bacitracin titers when Leucine addition (P<0.05).

圖3 外源Val添加對地衣芽胞桿菌DW2桿菌肽發(fā)酵效價的影響Fig. 3 Effects of Val addition on the bacitracin production.The different letters indicated the significant differences of bacitracin titers when Valine addition (P<0.05).

圖4 不同表達水平的轉運蛋白 YhdG對地衣芽胞桿菌桿菌肽發(fā)酵效價的影響Fig. 4 Effect of different expression levels of permease YhdG on bacitracin yield. The different letters indicated the significant differences of bacitracin titers among recombinant strains (P<0.05).

圖5 yhdG缺失和強化對yhdG轉錄水平的影響Fig. 5 Effects of deficiency and overexpression of yhdG on the yhdG transcriptional level. *P<0.05 and **P<0.01 indicate the significance levels between recombinant strains and control strain.

為了確定轉運蛋白YhdG的表達水平的確會影響桿菌肽效價，我們檢測了yhdG游離強化表達工程菌 DW2/pHY-yhdG和yhdG缺失工程菌 DW2△yhdG中基因yhdG在發(fā)酵 30 h (桿菌肽快速合成期) 的轉錄水平。結果如圖 5所示，DW2△yhdG中基因yhdG的轉錄水平為 0，說明該基因在 DW2△yhdG被成功敲除。而DW2/pHY-yhdG中yhdG的轉錄水平為對照菌株DW2/pHY300的32.65倍，說明YhdG強化表達菌株中yhdG的轉錄水平顯著提高。以上結果進一步說明yhdG表達量越低，越有利于桿菌肽的合成。

2.3 轉運蛋白基因yhdG缺失對桿菌肽發(fā)酵過程不同時期胞內外支鏈氨基酸濃度的影響

為了進一步確證轉運蛋白YhdG是通過影響胞內外支鏈氨基酸濃度從而影響桿菌肽效價的，我們隨后檢測了DW2△yhdG和出發(fā)菌株DW2在桿菌肽合成不同時期的胞內、胞外氨基酸含量。通過檢測桿菌肽發(fā)酵過程中24 h (桿菌肽合成初期)、30 h (桿菌肽快速合成期) 和48 h (發(fā)酵終點)的胞內外支鏈氨基酸濃度，發(fā)現(xiàn)與對照菌相比，工程菌DW2△yhdG的胞內、胞外的支鏈氨基酸濃度在桿菌肽合成初期基本一致，但是在桿菌肽快速合成期和發(fā)酵終點時，胞內支鏈氨基酸的濃度遠高于對照菌株地衣芽胞桿菌DW2。如圖6所示，在30 h桿菌肽快速合成時期，DW2△yhdG胞內支鏈氨基酸 (異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸) 的濃度分別達到24.51、11.18、21.25 μg/mL，分別比地衣芽胞桿菌DW2提高了6.27、5.36、5.9倍；而在48 h發(fā)酵終點，DW2△yhdG胞內支鏈氨基酸(異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸) 的濃度分別為22.59、14.54、25.18 μg/mL，仍然比對照菌株地衣芽胞桿菌DW2的支鏈氨基酸濃度提高了5.34、23.69、3.6倍。上述結果表明缺失轉運蛋白YhdG的確可以提高胞內支鏈氨基酸尤其是 Ile和 Leu的供應，從而達到提高桿菌肽產量的效果。與此同時，DW2△yhdG的胞外支鏈氨基酸含量在30 h和48 h時與DW2相比都出現(xiàn)了下降。DW2△yhdG胞內胞外支鏈氨基酸的檢測結果表明，轉運蛋白YhdG在地衣芽胞桿菌DW2中的功能可能為負責將胞內的支鏈氨基酸轉運到胞外，這與人們之前在枯草芽胞桿菌中得出的結論相反。

有研究表明YhdG在枯草芽胞桿菌中，除了負責支鏈氨基酸的攝入，還參與丙氨酸 (Ala)、蘇氨酸 (Thr)、絲氨酸 (Ser)、半胱氨酸 (Cys) 和天冬氨酸 (Asp) 的轉運。因此，我們隨后檢測了20種常見氨基酸的其他 17種氨基酸，其中精氨酸沒有檢測到。氨基酸檢測結果發(fā)現(xiàn)DW2△yhdG的胞內Ala、甘氨酸 (Gly)、脯氨酸 (Pro) 和甲硫氨酸 (Met) 的含量在桿菌肽合成后期高于DW2(圖7)。這表明在地衣芽胞桿菌DW2中氨基酸轉運蛋白YhdG并不是支鏈氨基酸的特異性轉運蛋白，其功能可能為負責將胞內氨基酸運輸?shù)桨狻?/p>

2.4 地衣芽胞桿菌DW2△yhdG發(fā)酵過程曲線

上述實驗結果表明，工程菌 DW2△yhdG的桿菌肽效價高于DW2，并且氨基酸檢測結果顯示其胞內Ile和Leu含量在桿菌肽合成時期的確大幅度提高。隨后，為了進一步探究YhdG缺失對發(fā)酵過程中菌體生長及桿菌肽合成的影響，我們檢測了工程菌DW2△yhdG及對照菌株DW2在發(fā)酵過程中的生物量和桿菌肽效價的變化曲線。結果如圖8所示，DW2△yhdG在發(fā)酵過程中的生物量略高于原始菌DW2，其原因可能是因為轉運蛋白YhdG缺失后，導致胞內支鏈氨基酸的含量提高，進而提高了支鏈脂肪酸的合成能力，從而提高了DW2△yhdG發(fā)酵過程生物量[24]。與此同時，yhdG缺失菌株在整合發(fā)酵過程中的效價都高于對照菌株DW2，這進一步證實了缺失轉運蛋白基因yhdG可以提高桿菌肽發(fā)酵效價。綜上所述，DW2△yhdG具有作為桿菌肽高產菌株的巨大潛力，而缺失轉運蛋白 YhdG是一種提高桿菌肽產量的合理策略。

圖6 缺失轉運蛋白YhdG對地衣芽胞桿菌菌株發(fā)酵過程中胞內胞外支鏈氨基酸的影響 (A：24 h胞內支鏈氨基酸濃度；B：30 h胞內支鏈氨基酸濃度；C：48 h胞內支鏈氨基酸濃度；D：24 h胞外支鏈氨基酸濃度；E：30 h胞外支鏈氨基酸濃度；F：48 h胞外支鏈氨基酸濃度)Fig. 6 Effects of deleting YhdGon the concentrations of intracellular and extracellular BCAA. (A) Concentrations of intracellular amino acids at 24 h. (B) Concentrations of intracellular amino acids at 30 h. (C) Concentrations of intracellular amino acids at 48 h. (D) Concentrations of extracellular amino acids at 24 h. (E) Concentrations of extracellular amino acids at 30 h. (F) Concentrations of extracellular amino acids at 48 h. *P<0.05; **P<0.01.

圖7 缺失轉運蛋白YhdG對地衣芽胞桿菌桿菌肽發(fā)酵過程的其他氨基酸的影響 (A：24 h胞內氨基酸濃度；B：30 h胞內氨基酸濃度；C：48 h胞內氨基酸濃度；D：24 h胞外氨基酸濃度；E：30 h胞外氨基酸濃度；F：48 h胞外氨基酸濃度)Fig. 7 Effect of deficiency of yhdG on the transportation of other amino acids during the bacitracin fermentation. (A)Concentrations of intracellular amino acids at 24 h. (B) Concentrations of intracellular amino acids at 30 h. (C)Concentrations of intracellular amino acids at 48 h. (D). Concentrations of extracellular amino acids at 24 h. (E)Concentrations of extracellular amino acids at 30 h; (F) Concentrations of extracellular amino acids at 48 h. *P<0.05,**P<0.01.

圖8 工程菌 DW2△yhdG在發(fā)酵過程中生物量和效價變化曲線Fig. 8 The biomass and bacitracin titer of DW2△yhdG during fermentation.

3 結論

本研究首先通過支鏈氨基酸添加實驗證實了提高Ile和Leu的供應可以提高桿菌肽效價，尤其是Ile的添加會顯著提高桿菌肽效價。隨后通過代謝工程手段敲除了地衣芽胞桿菌氨基酸轉運蛋白YhdG，獲得了一株高產桿菌肽的地衣芽胞桿菌工程菌DW2△yhdG，其桿菌肽效價達到917.35 U/mL，與原始菌 DW2相比提高了 11%，并且其生物量也略高于DW2。該研究結果表明DW2△yhdG具有作為桿菌肽高產菌株的巨大潛力，為桿菌肽高產菌株的改造提供了一種新的策略。

支鏈氨基酸都是桿菌肽的組成氨基酸，但氨基酸添加實驗結果卻發(fā)現(xiàn)只有Ile和Leu添加會提高桿菌肽的效價，其中Ile效果較為顯著，而Val添加基本不會影響桿菌肽的效價。同時，其他桿菌肽組成氨基酸添加實驗發(fā)現(xiàn)，除了 Ile和 leu外，只有Glu、Cys和Lys的添加會提高桿菌肽的效價[6]，這可能與桿菌肽的組成成分和桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕中的氨基酸組含量有關。桿菌肽含有A、B1、B2、C......G等多種組分，其中A、B1、B2約占95%以上的生物活性，其中A擁有最高的生物活性[3]，而分析桿菌肽A、B1、B2發(fā)現(xiàn)A與B1中有兩個Ile殘基，而Val只在B2中出現(xiàn)。同時，分析桿菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕的氨基酸含量發(fā)現(xiàn)，Ile、Leu和Val的比例分別為2.45%、3.70%和2.29%[6]，可能相比于細胞生長和合成桿菌肽的需求量，Ile和Leu仍然不足，而Val卻已經(jīng)基本能滿足生長和桿菌肽合成所需，這就導致Ile和Leu的添加可以提高桿菌肽效價，而Val添加基本沒有影響。

此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，在枯草芽胞桿菌中轉運蛋白YhdG負責通過支鏈氨基酸的攝入來維持胞內支鏈氨基酸的供給，因此yhdG的缺失使胞內氨基酸的濃度降低，從而影響氨基酸的供給和目的產物的合成。然而，本研究發(fā)現(xiàn)在地衣芽胞桿菌缺失轉運蛋白基因yhdG后，胞內支鏈氨基酸濃度顯著提高，胞外支鏈氨基酸濃度明顯降低。以上結果表明，yhdG的缺失提高了胞內支鏈氨基酸尤其是Ile和Leu的供給水平，與此同時，yhdG缺失菌株中桿菌肽的產量有所提高。另外，當強化表達YhdG時，桿菌肽的產量顯著下降，說明強化 YhdG的表達降低了胞內氨基酸的供給水平，從而影響了桿菌肽的合成。綜上所述，轉運蛋白YhdG在地衣芽胞桿菌DW2中的功能可能為負責將胞內的支鏈氨基酸轉運到胞外以維持支鏈氨基酸的平衡，這與人們之前在枯草芽胞桿菌中得到的結論相反[25-27]。與此同時，我們也檢測了20種常見氨基酸中的其余 17種氨基酸，發(fā)現(xiàn)DW2△yhdG的胞內Ala、Gly、Pro和Met的含量在桿菌肽合成后期高于DW2，由此說明YhdG并不是支鏈氨基酸的特異性轉運蛋白，這與人們之前在枯草芽胞桿菌中得出的結論相一致[19]。

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