林 華，黃興振

（1.廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006； 2.廣西醫(yī)科大學，廣西 南寧 530000）

柴胡 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.別名山柴胡、山菜、柴草，是中國傳統(tǒng)的藥用植物，具有兩千多年的藥用歷史。具有疏肝解郁、解表退熱和升舉陽氣等功效[1-2]，經(jīng)現(xiàn)代藥理學與臨床試驗證實，具有保肝、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用。研究發(fā)現(xiàn)，柴胡中含五環(huán)三萜類皂苷多達100多種，其中含量較多的為柴胡皂苷a，c，d[3-8]，主要藥理活性的物質為柴胡皂苷 a，d[9-13]。目前，以柴胡皂苷為主的單味及復方制劑，如解郁安神顆粒、柴胡口服液、逍遙丸等，臨床應用比較廣泛，療效顯著。柴胡藥材中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量已成為檢驗其質量的標準。

近年來，以柴胡為主藥的中成藥多采用薄層色譜法，以柴胡原藥材作為對照品對其進行定性鑒別。在含有柴胡的諸多中成藥中，對于柴胡皂昔a，d的含量測定研究并不多見，這是由于柴胡皂苷中的雙鍵數(shù)目較少，且柴胡皂苷a，d十分不穩(wěn)定，在高溫或酸性條件下很容易發(fā)生開環(huán)反應而降解[14-15]。因此，傳統(tǒng)的檢測手段較復雜，在生產(chǎn)過程中，更傾向于選擇芍藥苷、黃芩苷、甘草次酸等組分的含量作為測定指標。此外，還有利用大孔樹脂柱對中成藥進行處理，從而間接地測定其中柴胡皂苷的含量，但這些方法均存在方法繁復、耗時耗材等缺陷。對于含柴胡的中成藥，尚未建立以柴胡皂苷含量為指標的標準測定方法。

中成藥解郁安神顆粒由柴胡、丹皮、大棗、石菖蒲等多種藥材制成，有舒肝解郁、燥濕化痰、安神定志等功效，是一種典型的以柴胡皂苷a，d為主要藥用成分的中成藥[16-18]。因此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法檢測解郁安神顆粒中柴胡皂苷a，d的含量，具有柱效高、靈敏度高、分離時間短等優(yōu)點[19-22]。同時，本研究中對測定柴胡皂苷的HPLC法進行了方法學驗證，旨在建立一個重復性好、可操作性強的檢測柴胡皂苷的方法，不僅為解郁安神顆粒中柴胡皂苷含量的測定提供了可靠的方法，同時對加強以柴胡皂苷作為有效成分的中成藥的質量控制提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津2010高效液相色譜儀，紫外可見檢測器（日本島津公司）；Milli-Q direct超純水（美國Millipore公司）；RE52CS型旋轉蒸發(fā)儀，B-220型恒溫水浴鍋 （上海亞榮生化儀器廠）；AB 256-S型梅特勒電子天平（Mettler Toledo）。

1.2 試藥

解郁安神顆粒（神威藥業(yè)集團有限公司，批號為14060717，14061412，14070415）；柴胡皂苷 a 對照品（批號為 110777-201206）、柴胡皂苷 d對照品（批號為110777-201206），均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈均為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ThermoHypersilBDSC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：水（A 相），乙腈（B 相），梯度洗脫（見表 1）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：25℃；進樣室溫度：15℃。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

對照品溶液：取柴胡皂苷a對照品約2.88 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為576 μg/mL的柴胡皂苷a對照品溶液。取柴胡皂苷d對照品約3.24 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為648 μg/mL的柴胡皂苷d對照品溶液。

供試品溶液：取待測樣品約1.24 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加30 mL 10%氨水-甲醇溶液，超聲提取 30 min，離心 10 min，速率為 3 000 r/min。收集上清液，繼續(xù)提取2次。將3次提取所得上清液合并，用旋轉蒸發(fā)儀真空濃縮、干燥，得濃縮物。將得到的濃縮物置燒杯中，加10 mL水使其溶解，移入分液漏斗，加30 mL飽和正丁醇，混勻，靜置分層，收集醇層至另一錐形瓶，連續(xù)萃取2次。將萃取液合并，繼續(xù)加30 mL氨水，靜置分層，取醇層，重復3次。將醇萃取液經(jīng)旋蒸儀濃縮，干燥，加適量甲醇溶解，轉至10 mL容量瓶，加甲醇定容，搖勻備用。

陰性對照品溶液：按處方比例自制不含柴胡的顆粒，作為陰性對照品，再按供試品溶液的配制方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

干擾試驗：精密吸取2.2項下3種溶液各20 μL，按2.1項下色譜條件測定。結果，供試品溶液中其他成分不干擾測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：取配制好的2.2項下柴胡皂苷a對照品溶液，用甲醇稀釋成質量濃度分別為10，20，40，80，160，240，320 μg/mL 的對照品溶液。同樣取適量2.2項下柴胡皂苷d對照品溶液，稀釋成質量濃度分別為 10，20，40，80，160，240，320 μg/mL 的對照品溶液。HPLC分析，記錄峰面積。以對照品質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標計算回歸方程。柴胡皂苷a質量濃度在 20.25 ～311.46 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好，回歸方程為 Y=2.31×106X+1.86×103，r=0.999 7（n=7）；柴胡皂苷 d 質量濃度在 23.12～308.56 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好，回歸方程為 Y=4.18 ×106X+2.13 ×103，r=0.999 6（n=7）。

精密度試驗：取柴胡皂苷a對照品溶液與柴胡皂苷d對照品溶液，分別進樣20 μL，依法連續(xù)測定6次，記錄色譜峰面積，結果柴胡皂苷a的 RSD為1.46%（n=6），柴胡皂苷d的 RSD為2.67%（n=6），表明儀器精密度較好。

表2 柴胡皂苷a及柴胡皂苷d加樣回收試驗結果（n=6）

穩(wěn)定性試驗：取適量2.2項下供試品溶液，室溫條件下靜置 1 d，分別于 0，4，8，12，24 h 時進樣分析，記錄峰面積。結果柴胡皂苷a的 RSD為3.38%（n=5），柴胡皂苷d的 RSD為4.86%（n=5），表明供試品溶液室溫放置24 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：稱取同一批（批號為14060717）樣品5份，按2.2項下方法操作，進樣分析，記錄峰面積。結果柴胡皂苷 a，d的 RSD 分別為 1.63%和 3.05%（n=5），表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取同一批（批號為14060717）樣品6份置錐形瓶中，分別加適量柴胡皂苷a，d對照品溶液，依2.2項下方法制備供試品溶液，進樣分析，檢測柴胡皂苷a，d的含量。結果見表2。

2.4 樣品含量測定

取樣品（批號分別為 14060717，14061412，14070415），按2.2項下方法制備溶液，測得3批樣品中柴胡皂苷a的含量分別為 0.77，0.74，0.81 mg/g，柴胡皂苷 d 的含量分別為 1.54，1.47，1.68 mg/g。

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

由柴胡皂苷a，d的結構可知，柴胡皂苷a，d很容易受到酚類及酸性組分的干擾而使環(huán)氧醚鍵斷裂，降解生成柴胡皂苷b1，b2。因此，本研究中在對解郁安神顆粒中的柴胡皂苷a，d的提取過程中以甲醇作為提取溶劑，既保證了柴胡皂苷a，d在溶劑中有足夠的溶解度，又利用了氨水的堿性，中和了解郁安神顆粒中其他酸性成分，避免了柴胡皂苷a，d在提取過程中的降解。同時，本研究中采用超聲的方法對柴胡皂苷a，d進行提取，超聲提取法具有提取效率高、提取溶劑用量少且提取時間短等優(yōu)點，達到了提取高效、迅速的目的。

3.2 萃取溶劑選擇

分析柴胡皂苷a，d的理化性質可知，兩者在水或水飽和的正丁醇溶液中的溶解度較大，難溶于或不溶于苯、乙醚、氯仿等溶劑。因此，本研究中在對柴胡皂苷a，d進行粗提取后，又進一步通過液-液萃取的方式進行除雜。試驗發(fā)現(xiàn)，通過正丁醇對胡皂苷a，d進行萃取后，能除去粗提物中的酸性干擾成分，分離效果良好。

3.3 檢測波長選擇

在柴胡皂苷的結構中，雙鍵的個數(shù)很少或無雙鍵，故本試驗制備柴胡皂苷a的標準溶液，采用紫外分光光度計于200～400 nm波長范圍進行掃描，溶液在210 nm波長附近有最大吸收。因此，檢測時，選擇末端吸收210 nm對柴胡皂苷進行檢測。

3.4 流動相選擇

首先，由于柴胡皂苷a，d均為紫外末端吸收，當選擇甲醇作為流動相時，此時甲醇的本底與試驗中所采用的檢測波長相近，會對柴胡皂苷的測定造成較明顯的干擾。因此，本試驗選擇乙腈-水作為流動相進行洗脫。其次，由于柴胡皂苷a，c，d 3種成分的極性差異較大，同時，在解郁安神顆粒中還含有其他化學組分，故利用等度流動相進行洗脫時不能使全部樣品的柴胡皂苷a，d得到良好分離，故采取梯度洗脫。

3.5 樣品含量測定方法選擇

由對柴胡皂苷a，d含量測定的結果可見，在梯度洗脫過程中，柴胡皂苷a首先被洗脫出來，隨著流動相中乙腈比例的不斷增加，柴胡皂苷d被洗脫出來，兩者在此液相條件下可以完全分離。究其原因，可能與柴胡皂苷a，d的理化性質有關，雖然從所含有的官能團的種類與數(shù)量看，柴胡皂苷a，d均相同，但是比較兩者的結構可以發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷a，d是一對立體異構體，16位的—OH的立體構型。因此，立體結構的不同可能導致了兩者出峰時間的差異。

解郁安神顆粒是以柴胡作為君藥，丹皮、大棗等作為佐藥，柴胡的有效物質成分中柴胡皂苷a，d含量最多，藥理活性更明顯，柴胡皂苷a，d的含量成為中成藥解郁安神顆粒的質控標準。柴胡皂苷a，d的結構中均存在氧環(huán)，而且不飽和雙鍵極少，故柴胡皂苷a，d的氧環(huán)極易在酸性條件下開環(huán)降解，兩者的提取需在弱堿性條件下操作，并于210 nm紫外波長下檢測。

3.6 研究價值

本研究中建立了同時測定解郁安神顆粒中柴胡皂苷a，d含量的HPLC法，可用于解郁安神顆粒中柴胡部分的質量控制。由于含有柴胡的中成藥成分較為復雜，決定了這類藥物在質量控制過程中存在一定的缺陷，如果中成藥的質量檢驗標準不具有專屬性與代表性，那就無法從根本上控制中成藥的質量。因此，本研究中為實現(xiàn)含有柴胡的中藥制劑的質控奠定了試驗基礎，為建立以柴胡皂苷含量為指標的標準提供了重要參考，具有十分重要的現(xiàn)實意義。

[1]肖功勝，楊 云，劉富崗，等.柴胡皂苷提取和含量測定方法研究[J].中成藥，2009，31（4）：595-598.

[2]楊瑤，閻玉凝，楊 洋，等.阿爾泰柴胡中柴胡皂苷a、c、d的含量測定[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2008，31（11）：777-780.

[3]章佳.含柴胡的常用中成藥中柴胡皂苷含量的測定及研究[D].上海：復旦大學，2010.

[4]王 健，王 博，滕利榮，等.高效液相色譜測定克郁舒神顆粒中柴胡皂苷a含量[J].中國實驗方劑學雜志，2006，12（5）：7-9.

[5]高紅梅，張嘯環(huán).高效液相色譜法測定解郁安神顆粒中梔子苷的含量[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2011，27（1）：13-14.

[6]Zhang GS，Hu PY，Li DX，et al.Formulations，hemolytic and pharmacokinetic studies on saikosaponin a and saikosaponind compound liposomes[J].Moleculaes，2015，20（4）：5889-5907.

[7]Lee TH，Park SH，You MH，et al.A potential therapeutic effect of Saikosaponin C as a novel dual-target anti-Alzheimer agent[J].Journal of Neurochemistry，2015，12（8）：23-27.

[8]Cui BS，Qiao YQ，Yuan Y，et al.Hepatoprotective saikosaponin homologs from Comastoma pedunculatum[J].Planta Medcine，2014，80（17）：1647-1656.

[9]Zhao H，Li S，Zhang H，et al.Saikosaponin A protects against experimental sepsis via inhibition of NOD2-mediated NF-κB activation[J].Experimental and Therapeutic Medicine，2015，10（2）：823-827.

[10]Chen J，Duan M，Ling F，et al.Saikosaponin A inhibits influenza A virus replication and lung immunopathology[J].Oncotarget，2015，6（40）：42541-42556.

[11]MaX，DangC，KangH，etal.Saikosaponin-D reduces cisplatin-induced nephrotoxicity by repressing ROS-mediated activation of MAPK and NF- κB signalling pathways[J].International Immunopharmacology，2015，28（1）：399-408.

[12]Chen X，Yu T，Chen Z，et al.Effect of saikosaponins and extracts of vinegar-baked Bupleuri Radix on the activity of βglucuronidase[J].Xenobiotica，2014，44（9）：785-791.

[13]Oko OOK，Agiang EA.Phytochemical activities of Aspilia africana leaf using different extractants[J].Indian Journal of Animal Sciences，2011，81（8）：30-34.

[14]劉香玉，田民強，馮麗莉，等.復方解郁顆粒的質量標準研究[J].中國藥師，2014，17（5）：763-766.

[15]吳 敏.解郁顆粒的制備工藝及質量標準研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學，2004.

[16]熊夢曉，黃必勝，白 楊，等.RP-HPLC法測定保康北柴胡中柴胡皂苷 a、d 的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2007，21（2）：42-44.

[17]趙白云，朱臻宇，王 彬，等 .HPLC-DAD-TOF/MS法測定小柴胡湯中柴胡皂苷a、黃芩苷和甘草酸的含量[J].第二軍醫(yī)大學學報，2007，28（5）：527-530.

[18]張宏娜，趙玉英，梁 鴻，等.HPLC-ELSD法同時測定柴胡中柴胡皂苷 a、c、d、f的含量[J].藥物分析雜志，2007，27（8）：1150-1153.

[19]李 軍，姜 華，張延萍，等.HPLC測定柴黃片中柴胡皂苷b1、b2 的含量[J].中國藥學雜志，2011，46（1）：61-63.

[20]王嘉林，王斯坦.HPLC-MSMS測定小柴胡顆粒中柴胡皂苷a與柴胡皂苷 d[J].安徽醫(yī)藥，2015，19（3）：453-456.

[21]塔 娜，李常勝，松 林，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地北柴胡中柴胡皂苷 a、c、d 的含量[J].中醫(yī)藥導報，2013，19（6）：79-80.

[22]浦錦寶，梁衛(wèi)青，鄭軍獻，等.HPLC-ELSD測定柴胡總皂苷中柴胡皂苷 a、d 的含量[J].中國中醫(yī)藥科技，2010，17（5）：430-431.