楊 曦，黃偉偉，盧 建

目前全世界大約有15%的夫婦不育，其中男性不育約占50%[1]。引起男性不育的因素有很多，非遺傳因素的有隱睪、精索靜脈曲張、輸精管阻塞、生殖系統(tǒng)感染、內(nèi)分泌紊亂等[2]。由遺傳缺陷引起的精子發(fā)育障礙約占男性不育的30%，遺傳因素的有克氏綜合征性、Y染色體微缺失等，Y染色體微缺失是除了克氏綜合征導(dǎo)致男性特發(fā)性不育的第二大遺傳因素[3-4]。Y染色體微缺失是由于Y染色體上的精子生成基因(azoospermia factor,AZF)發(fā)生了微缺失，AZF基因與精子生成有關(guān)分，其存在互不重疊的3個(gè)區(qū)域，即AZFa、AZFb和AZFc[1]。本文應(yīng)用多重定量熒光PCR(quantitative fluorescent PCR,QF-PCR)毛細(xì)管電泳法[3,5]，對(duì)無(wú)精子癥和少精子癥的患者中進(jìn)行Y 染色體AZF微缺失常規(guī)篩查，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年1月至12月于廣東省婦幼保健院就診的精子發(fā)生障礙男性不育患者647例，年齡(32.8±6.1) 歲。按照WHO精液分析標(biāo)準(zhǔn)確診為無(wú)精癥120例、嚴(yán)重少精60例、少精癥467例,使用EDTA·K2真空采血管抽取靜脈血2 mL。WHO精液分析標(biāo)準(zhǔn)：3次檢查精子密度，且精液離心后也未能發(fā)現(xiàn)精子為無(wú)精; 精子密度<5×106·mL-1為嚴(yán)重少精；精子密度<15×106·mL-1為少精。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取使用達(dá)安基因公司的Smart 32核酸提取儀，廣州美基生物公司的磁珠提取試劑盒進(jìn)行外周血DNA提取，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。使用NanoDrop 2000 進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)。

1.2.2PCR擴(kuò)增PCR引物使用歐洲男科協(xié)會(huì)/歐洲分子遺傳質(zhì)量協(xié)作網(wǎng)(European Academy of Andrology/European Molecular Genetics Quality Network,EAA/EMQN)推薦的序列位置標(biāo)簽(sequence tagged site,STS)[6]，每個(gè)AZF區(qū)域使用2個(gè)STS序列，AZFa：SY84、SY86，AZFb：SY127、SY134，AZFc：SY254、SY255，以SRY(SY14)和 ZFAX/Y位點(diǎn)為內(nèi)對(duì)照，PCR引物末端FAM、JOE和TAMRA熒光基團(tuán)標(biāo)記。擴(kuò)增體系為PCR Mix 12.5 μL,引物混合物[3]2.5 μL,模板DNA 3 μL，滅菌水7 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，54 ℃，30 s，72 ℃，60 s，共28個(gè)循環(huán)；60 ℃,60 min。設(shè)置2個(gè)對(duì)照：空白水對(duì)照、正常男性對(duì)照。

1.2.3PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳檢測(cè)在96孔板中加入上樣體系，包括去離子甲酰胺9 μL，LIZ-500分子內(nèi)標(biāo) 0.5 μL，標(biāo)記 PCR產(chǎn)物 1 μL, 總體積 10.5 μL。 在95 ℃下加熱變性4 min，然后立即冰上放置 3 min，短暫離心后將96孔板放入ABI 3 500×L測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，用GeneMaker(version2.2.0)軟件對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

Y染色體AZF微缺失檢測(cè)的649例患者中，檢測(cè)出Y染色體AZF缺失17 例，缺失率為2.63% (17/647) ，如表1所示。其中AZFa缺失僅1例，AZFc缺失14例，AZFb、AZFc雙重缺失2例。圖1為正常男性的毛細(xì)管電泳結(jié)果，從圖中可以看出SRY、ZFAX/Y內(nèi)對(duì)照出現(xiàn)了峰，AZF基因3個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)6個(gè)STS對(duì)都出現(xiàn)了峰，說(shuō)明AZF基因沒(méi)有出現(xiàn)微缺失。圖2為AZFc缺失患者毛細(xì)管電泳結(jié)果，從圖中可以看出AZFc區(qū)域?qū)?yīng)的2個(gè)STS沒(méi)有峰出現(xiàn)，說(shuō)明AZFc區(qū)域出現(xiàn)微缺失。

表1 Y染色體AZF缺失病例總數(shù)

圖1 GeneMaker軟件分析正常男性AZF微缺失檢測(cè)結(jié)果

圖2 GeneMaker軟件分析AZFc微缺失患者檢測(cè)結(jié)果

3 討論

Y染色體AZF區(qū)域有編碼精子生成基因，其缺失導(dǎo)致男性生精功能異常，與男性不育密切相關(guān)，男性因素所致不孕患者中AZF微缺失率1.3%～14%[7]。AZF通常分AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)不同亞區(qū)。

AZFa的缺失較少見(jiàn)，約占Y染色體微缺失的1%～5%，本文僅檢測(cè)出1例AZFa缺失，AZFa缺失的患者最為嚴(yán)重，通常表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征(sertoli cell only syndrome,SCOS)，臨床表現(xiàn)為無(wú)精子癥[8]。AZFb基因缺失的患者表現(xiàn)為生精阻滯，主要停留在精母細(xì)胞或精子細(xì)胞階段，睪丸內(nèi)可見(jiàn)精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，但無(wú)精子生成；如果同時(shí)伴有AZFa或AZFc的缺失，則表現(xiàn)為SCOS或生精阻滯[9]。Y染色體微缺失較為常見(jiàn)AZFc缺失[10]，本研究中共檢測(cè)出16例AZcF缺失，14例AZFc單獨(dú)缺失，2例為AZFb、AZFc雙重缺失。AZFc缺失的患者其精子數(shù)目有進(jìn)行性下降的趨勢(shì)，臨床表現(xiàn)多種多樣，可無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥患者，也可表現(xiàn)為精子計(jì)數(shù)正常但伴有精子形態(tài)異常[2,8]。AZFa、AZFb完全缺失臨床表現(xiàn)較為嚴(yán)重，由于患者行睪丸穿刺也不能獲得精子，因此對(duì)于該類患者也沒(méi)有必要做單精子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)，只能通過(guò)他人供精的方式生育后代。一般單獨(dú)AZFc缺失患者尚有精子生成能力，可以做ICSI，但是會(huì)將AZFc缺失遺傳給男性后代，女性后代不孕的風(fēng)險(xiǎn)通常不會(huì)增加，患者可以進(jìn)行胚胎移植前基因診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)，選擇女胚進(jìn)行移植[10-11]。

EAA/EMQN發(fā)布的Y染色體微缺失的檢測(cè)指南，推薦檢測(cè)分別位于AZFa、AZFb 和 AZFc 3個(gè)區(qū)域的sY84、sY86、sY127、sY134、sY254和sY255 6個(gè)STS位點(diǎn)，即每個(gè)區(qū)域2個(gè)STS 位點(diǎn)。以SRY(SY14)和ZFX/Y位點(diǎn)為內(nèi)對(duì)照，SRY是Y染色體特有基因，ZFX/Y在X/Y染色體上都存在。本文中的PCR擴(kuò)增引物序列為這8個(gè)STS位點(diǎn)[3,5]。

目前臨床上用于Y 染色體微缺失的檢測(cè)方法很多，有實(shí)時(shí)熒光PCR、基因芯片、多重 PCR電泳、QF-PCR等。實(shí)時(shí)熒光PCR操作簡(jiǎn)單可以實(shí)現(xiàn)邊擴(kuò)增邊檢測(cè)，靈敏度高，有一定的假陽(yáng)性；另外熒光PCR儀一般只有4～5種熒光信號(hào)通道，一次只能檢測(cè)4～5個(gè)指標(biāo)，所以對(duì)于8個(gè)STS位點(diǎn)需要分2個(gè)PCR管擴(kuò)增檢測(cè)[1]?；蛐酒≒CR擴(kuò)增完成后需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，操作較電泳法麻煩、費(fèi)時(shí)間。國(guó)內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室主要使用多重PCR電泳進(jìn)行檢測(cè)，僅需普通PCR儀和瓊脂糖電泳設(shè)備即可，但由于瓊脂糖電泳不能區(qū)分相近的大小DNA片段，另外顯色靈敏度也底，需要將引物分多組分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳才能進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)[9]。而QF-PCR法需要對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，由于熒光信號(hào)靈敏度較高，毛細(xì)管電泳DNA片段大小分度辨高，一管多重PCR擴(kuò)增可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)STS位點(diǎn)檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果容易判讀，但需要測(cè)序儀，可能限制其在臨床的推廣[3]。

Y染色體微缺失的檢測(cè)，可以為部分原因不明的無(wú)精癥或少精癥患者從分子水平上明確病因，為臨床醫(yī)師的診療提供臨床依據(jù)；避免患者不恰當(dāng)?shù)闹委?，減少患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，為臨床輔助生殖和遺傳咨詢提供指導(dǎo)。

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