王艷杰，楊彥娟,康芯榮，孫陽，李明珠，劉旭，劉宏，代巧妹(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

臨床上在治療腫瘤患者時(shí)，多采用攻邪軟堅(jiān)或健脾和胃法，有學(xué)者認(rèn)為補(bǔ)益劑滋膩中焦，阻遏運(yùn)化，不宜使用[1]。但近年來有大量研究表明一些補(bǔ)益劑在抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中能夠起到作用，包括當(dāng)歸補(bǔ)血湯[2]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是李東垣所創(chuàng)益氣補(bǔ)血名方,多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠在腫瘤放、化療中起到增效減毒的作用[3]，但鮮有研究表明單獨(dú)使用當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有抑瘤作用[4]。因此我們選用不同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯，對(duì)S180荷瘤小鼠進(jìn)行抗腫瘤研究，以了解其抑瘤作用的免疫學(xué)因素。

1 試劑、材料和儀器

1.1 藥物與試劑

當(dāng)歸補(bǔ)血湯(黃芪90 g，當(dāng)歸18 g)均購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局。采用傳統(tǒng)方法水煎煮108 g的生藥，兩次藥液混合，靜置2 h分層，取上層清液，與下層渾濁液離心后的上清液混合，濃縮至231 mL,約0.47g生藥/mL，留31 mL(作低劑量組)，余下繼續(xù)濃縮至100 mL，約0.94 g生藥/mL，留40 mL(作中劑量組)，余下濃縮至40 mL，約1.41 g生藥/mL(作高劑量組)。儲(chǔ)4 ℃?zhèn)溆?。環(huán)磷酰胺(CTX)(上海如吉生物科技有限公司，編號(hào)131011)。0.9%氯化鈉注射液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H23020612)。95%乙醇(AR，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)。小鼠白介素2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒 (武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.2 主要溶液的配制

PBS(現(xiàn)用現(xiàn)配)：A.稱取Na2HPO4·12H2O 35.81 g加500 mL蒸餾水，B.稱取NaH2PO4·2H2O 3.9 g加125 mL蒸餾水。量取A.385 mL+B.115 mL+ 500 mL生理鹽水混合均勻，即配成0.1 mol/L、pH7.3的磷酸鹽緩沖溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株

60只ICR雌雄各半小鼠(準(zhǔn)字號(hào)：SCXK(黑)2013-004)，體質(zhì)量18～22 g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心供應(yīng)。S180細(xì)胞株：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。

1.4 主要儀器

超凈工作臺(tái)HFsafe-1200(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平FA124(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)KA-1000(上海安亭科學(xué)儀器廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱DGX-9143B-1(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電熱恒溫水浴鍋HH·S11-2-Ⅱ(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)； Infinite?M1000 Pro全波長多功能酶標(biāo)儀(瑞士帝肯 ，Tecan)。

2 方法

2.1 造模方法

采用腹腔接種瘤株的昆明種小鼠，7 d傳代1次，經(jīng)過3次傳代后。選取接種7 d的小鼠5只，酒精局部消毒并抽取非溶血性腹水，共5 mL，生理鹽水稀釋、調(diào)整懸液濃度為1×106/mL，除正常組，以每只0.2 mL于其余50只小鼠右腋窩皮下消毒并接種。

2.2 分組及給藥

60只小鼠隨機(jī)分為正常組、陰性組、陽性(CTX)組(0.03 g/kg)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高(14.04生藥/kg)、中(9.36 g生藥/kg)、低劑量組(4.68 g生藥/kg)。

接種瘤細(xì)胞后第2天開始給藥，陰性組每日生理鹽水灌胃0.2 mL/只；陽性組每只小鼠按0.03 g/kg隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺；當(dāng)歸補(bǔ)血湯各組每日灌胃水煎劑0.2 mL/只。連續(xù)給藥10 d。

2.3 實(shí)驗(yàn)記錄

末次給藥次日，稱體質(zhì)量，眼球取血待用，斷頸法處死各組小鼠，剝?nèi)×?、肝臟、脾臟并稱重記錄。計(jì)算體質(zhì)量的變化、抑瘤率及各臟器指數(shù)。計(jì)算公式如下：

抑瘤率(%)=(1-給藥組平均瘤量/造模組平均瘤重)×100%

臟器指數(shù)= 臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。檢驗(yàn)正態(tài)性，呈正態(tài)分布(若非正態(tài)分布用方法二)則用One-Way ANOVA方差分析，方差齊則用LSD-t進(jìn)行組間比較(若方差不齊用方法二)。方法二：非正態(tài)分布或方差不齊的應(yīng)用多獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis Test)。P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體質(zhì)量變化情況

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)后均有增加，陽性組增長最少，其余給藥組增長明顯。見表1。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)移植性S180荷瘤小鼠體質(zhì)量影響的比較

3.2 抑瘤率、移植瘤生長抑制率

與陰性組相比，給藥各組的瘤重均低于陰性組，且存在顯著性差異(P<0.01)；陽性組抑瘤率84.45%，其瘤重顯著低于其余給藥組(P<0.01)；當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、高組抑瘤效果(抑瘤率分別為均顯著高于低劑量組抑瘤效果P<0.01)，且中劑量組較高，但兩組無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)移植性S180荷瘤小鼠的瘤生長影響的比較

注：與陰性組比較，▲▲P<0.01；與陽性組比較，**P<0.01；與當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組比較，##P<0.01

3.3 肝指數(shù)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，陰性組肝、脾指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與陰性組相比，陽性組肝、脾指數(shù)均顯著下降(P<0.01)；當(dāng)歸補(bǔ)血湯各組肝、脾指數(shù)與陽性組相比顯著性升高(P<0.05)。見表3。

3.4 腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察

當(dāng)歸補(bǔ)血湯各組瘤體經(jīng)固定后取出修整，流水沖洗12 h，放入包埋機(jī)經(jīng)徹夜脫水、透明，第二日即刻取出包埋、切片、展片、烘片后，再進(jìn)行HE染色并封片，腫瘤組織切片即制作完成。

如圖1中所示，顯微鏡下觀察腫瘤組織，陰性組瘤細(xì)胞排列緊密，大量瘤細(xì)胞核質(zhì)色深呈多葉型、核質(zhì)比大，提示瘤細(xì)胞處于生長、分化旺盛階段。當(dāng)歸補(bǔ)血湯組瘤細(xì)胞排列稀疏，核深染的瘤細(xì)胞占比隨給藥劑量加大而降低，組織內(nèi)出現(xiàn)破裂、空洞，部分區(qū)域被非瘤組織取而代之，低劑量組及陰性組有血管存在，高劑量組與中劑量組未見大量血管。

表3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)移植性S180荷瘤小鼠免疫器官影響的比較

注：與正常組比較，##P<0.01；與陰性組比較，▲▲P<0.01；與陽性組比較，*P<0.05

圖1 腫瘤組織形態(tài)圖(10×40)

3.5 各組藥物對(duì)小鼠血清IL-2的影響

小鼠血液靜置2 h，3 000 r/min離心20 min，取上清液，使用相應(yīng)ELISA試劑盒按照說明書測(cè)定陰性組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、高劑量組血清中IL-2的濃度(由于低劑量組抑瘤率較低，只選擇兩個(gè)劑量組測(cè)試)。與陰性組相比，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、高劑量組IL-2顯著性升高(P<0.01)見表4和圖2。

4 討論

當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)S180荷瘤小鼠有抑瘤作用，從抑瘤率來看，隨著劑量增大，抑瘤率升高緩慢，以中劑量(9.36g生藥/kg)抑瘤率最高；從HE染色后的切片觀察結(jié)果來看，高劑量組腫瘤組織中浸入的炎性細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞凋亡狀態(tài)較中劑量明顯。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有二：一是與操作者的瘤株剝離手法，導(dǎo)致瘤重的誤差；二是腫瘤切片的制備手法，導(dǎo)致切片斷面不同導(dǎo)致。

表4 當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)移植性S180荷瘤小鼠細(xì)胞因子IL-2水平的影響比較

注：與陰性組比較，▲▲P<0.01

圖2 荷瘤小鼠血清IL-2標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

當(dāng)歸補(bǔ)血湯各組肝、脾指數(shù)均明顯升高，且與陰性組無顯著差異，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)免疫器官中免疫細(xì)胞具有活化作用，增強(qiáng)了免疫器官的防御能力。同時(shí)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能促進(jìn)免疫器官中的免疫細(xì)胞IL-2的分泌。IL-2是主要由活化的CD4+Th1細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，參與腫瘤監(jiān)視。IL-2也能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，提高NK細(xì)胞活性，NK細(xì)胞又能促進(jìn)IFN-γ分泌，而IFN-γ是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子。

綜合以上各種因素，可以推測(cè)當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗腫瘤作用是通過提高機(jī)體免疫器官的防御能力，活化免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2，促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤入腫瘤組織，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。這與已有報(bào)道稱當(dāng)歸補(bǔ)血湯提取液能通過提高IL-2和IFN-γ來能增強(qiáng)CTL細(xì)胞毒效應(yīng)以抗腫瘤的作用是一致的[5]。

[1] 楊青青.對(duì)惡性腫瘤患者化療所致不良反應(yīng)的中醫(yī)護(hù)理[J].中國醫(yī)藥指南,2012,10(3):272-274.

[2] 李嬌,劉曉波.中藥在腫瘤治療中的減毒增效作用的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)研究,2015,34(4):229-231.

[3] 黃朝忠,劉智,蘇穎.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腫瘤化療增效減毒作用的研究進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥,2014,34(9):962-964.

[4] 孫玉敏,宋福成,吳曉光.當(dāng)歸補(bǔ)血湯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,6(9):31-32，35.

[5] 劉清君,胡敏棣,劉彩梅,等.超濾膜提取當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞IL-2和IFN-γ的誘生作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,29(4):472-474.