張景珍，王英姿，李文華，張春泥，王思雨，聶瑞杰，孫振陽(北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488)

川楝子為常用傳統(tǒng)中藥，有小毒，臨床使用時多采用2015版《中國藥典》收載的清炒法炮制后入藥，以達到減毒的目的。炒川楝子可緩和苦寒之性，減少滑腸之弊，而且能增強理氣止痛、鎮(zhèn)痛抗炎的作用[1]，但是目前對其炮制減毒增效的作用機理尚不明確。吸收是研究中藥發(fā)揮作用、產生療效或發(fā)生毒副反應的基礎和關鍵，也是闡明有毒中藥炮制機理的重要環(huán)節(jié)[2]，因此科學研究中藥腸吸收動力學，探究其腸吸收特性是極為必要的。

本文采用在體腸灌流模型，以川楝素為指標成分研究川楝子炒制前后其提取物對大鼠在體腸吸收特性的影響，以探索其炮制前后主要化學成分在體內的吸收差異及變化，為臨床合理安全使用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物

健康雄性Wistar大鼠，SPF級，體質量250 g左右，購自斯貝福實驗動物科技有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0002。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；BT101L蠕動泵(保定雷弗流體科技有限公司)；HJ-6A多頭磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司)；HH-2數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；DCY系列可調式氮吹儀(青島?？苾x器有限公司)； BT125D電子天平(北京賽多利斯有限公司)；德國Eppendorf移液槍。

1.3 藥物與試劑

川楝素(上海詩丹德)、川楝子生品提取物、川楝子炒品提取物供試品(實驗室自制)；Krebs-Ringer's試劑(每1000 mL含六水合氯化鎂0.084 g,氯化鉀0.35 g,氯化鈉7.80 g,氯化鈣0.37 g,葡萄糖1.48 g,碳酸氫鈉1.37 g,磷酸二氫鈉0.02 g，pH7.4，簡稱為K-R液，購于國藥集團化學試劑有限公司)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)；十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS，北京市福晨化學試劑廠)；甲醇、乙腈為色譜純；乙酸乙酯為分析純。

2 實驗方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 Krebs-Ringer's(K-R)營養(yǎng)液的配制

稱取六水合氯化鎂0. 084 g,氯化鉀0. 35 g,氯化鈉7. 80 g,氯化鈣0. 37 g,葡萄糖1.48 g,碳酸氫鈉1. 37 g,磷酸二氫鈉0. 02 g，溶解于1 000 mL去離子水中用1 mol/LHCl調pH至7.4。

2.1.2 川楝素對照品溶液的配制

精密稱取5.47 mg川楝素對照品于5 mL容量瓶中，配制成1.094 mg/mL的對照品儲備液。

2.1.3 生川楝子提取物供試液的配制

精密量取一定量川楝子生品提取物，加含0.8% SDS的K-R溶液定容至100 mL。

2.1.4 炒川楝子提取物供試液的配制

精密量取一定量炒川楝子提取物，加含0.8% SDS的K-R溶液定容至100 mL。

2.2 在體腸吸收實驗

2.2.1 腸灌流液收集

試驗前將管道用供試液飽和，至出口液與供試液濃度一致，以消除試驗中管道對藥物的吸附。大鼠于12～18 h內禁食不禁水，以10%水合氯醛按0.4 g/kg進行腹腔注射麻醉。將大鼠于鼠板固定，在紅外燈下保溫，沿腹中線切開腹腔，分離待考察腸段(各腸段區(qū)間為：十二指腸自幽門1 cm處開始取10 cm；空腸段自幽門15 cm處開始取10 cm；回腸自盲腸上行20 cm處往下量取10 cm；結腸段從盲腸后端開始取10 cm)，兩端切口并插管，用預熱至37 ℃的K-R液將腸內容物沖洗干凈(流出液中無可見物)，結扎，用K-R溶液平衡15 min，泵入空氣排盡K-R液。再取供試液灌入腸道，用蠕動泵在進口處用質量已知含有供試液的小瓶灌流腸段，體積流量設定0.2 mL/min，開始計時，約30 min 后吸收平穩(wěn)。出液口處用另一已稱總質量的小瓶收集，每隔15 min迅速更換1次供試液小瓶和收集液小瓶，分別在45～180 min取樣，稱定質量，計算灌入和收集的供試液質量。在-20 ℃冷凍貯存樣品，待測。實驗結束后剪下相應的腸段，測量長度(L) 和內半徑(r)。

2.2.2 空白腸灌流液的收集

取Wistar大鼠，按照2.2.1項下操作用K-R溶液對十二指腸、空腸、回腸、結腸進行灌流3 h，收集腸道不同部位的灌流液，混合均勻，用于本實驗方法學考察所需樣品的配制。

2.2.3 生川楝子和炒川楝子提取物中川楝素在腸道中的吸收

取Wistar大鼠，分別按照2.2.1項下操作用生川楝子提取物供試液和炒川楝子提取物供試液對十二指腸、空腸、回腸、盲腸部位進行灌流，收集45～180 min灌流液，并稱重。

2.2.4 樣品處理方法

精密吸取灌流液500 μL，加乙酸乙酯1 mL渦旋3 min，6 000 r/min離心10 min，吸取上層乙酸乙酯900 μL，再加入乙酸乙酯1mL渦旋3 min，6 000 r/min離心10 min，吸取上層乙酸乙酯1mL，合并兩次萃取液，氮氣吹干，加甲醇500 μL復溶，過0.45 μM濾膜，取20 μL進行液相分析。

2.3 方法學考察

2.3.1 色譜條件

Extend C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)(33∶67)；流速1.0 mL/min，檢測波長為215 nm，柱溫30 ℃，進樣體積20 μL。

2.3.2 專屬性考察

分別取空白腸灌流液、對照品空白灌流液、提取物灌流液各500 μL，按上述“樣品處理方法”項下渦旋離心處理，按“色譜條件”項下進樣分析，空白灌流液中的成分不影響川楝子提取物中指標成分川楝素的含量測定。

2.3.3 線性關系考察

將川楝素對照品儲備液用甲醇稀釋成437.6、218.8、109.4、54.7、27.35、13.625和6.813 5 μg/mL的標準曲線工作液。分別精密吸取上述標準曲線工作液500 μL，置于2 mL EP管中，于通風櫥37 ℃恒溫水浴上氮氣吹干，加空白灌流液500 μL，渦旋3 min，按“樣品處理方法”項下操作，建立標準曲線。以濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得其標準曲線方程為：Y=22 143X-118 504，R2=0.996 1，表明川楝素在6.813 5～437.6 μg/mL范圍內的線性關系良好。

2.3.4 精密度與準確度的考察

用空白腸灌流液分別配制低、中、高3種濃度的質控樣品(QC)，按上述“樣品預處理方法”項下進行樣品處理，將同一樣品與同一天的早、中、晚各進針1次，分別計算其RSD值，即為其日內精密度。將同一樣品連續(xù)3 d進樣，分別計算其RSD值，即為日間精密度。用空白腸灌流液分別配制低、中、高3種濃度的質控樣品各5份，按上述“樣品預處理方法”項下處理進樣測定，分別計算其日內精密度的RSD值為3.9%～11.2%，日間精密度的RSD值為3.2%～10.1%，準確度的RSD值為2.5%～11.0%，均符合藥物分析的要求。

2.3.5 回收率考察

用空白腸灌流液分別配制高、中、低濃度的混標質控樣品，每個濃度進行5樣本分析(n=5)，按“樣品預處理方法”項下處理，在上述色譜條件下進液相檢測，獲得相應峰面積。按由甲醇溶液配制的系列濃度所得的標準曲線方程計算濃度，以測定濃度與加入濃度之比計算回收率，測得其結果為6.43%～8.65%，符合藥物分析的要求。

2.3.6 穩(wěn)定性考察

用空白腸灌流液配制與供試液相同濃度的川楝子生品提取物和川楝子炒品提取物各3份，置37 ℃恒溫水浴中3 h，分別于0、30、60、90、120、180 min取樣分析(n=3)，將所測得的川楝素含量與0時所測值作百分比，結果表明，川楝素穩(wěn)定性良好，RSD值均小于5%。說明在川楝子炒制前后提取物中川楝素在空白腸灌流液中穩(wěn)定性良好。

2.4 數據分析

分別取不同時間段灌流液按“2.2.4樣品預處理方法”項下處理，按“2.3.1色譜條件”項下進樣分析。采用重量法按如下公式計算藥物的吸收速率常數(Ka)和藥物表觀滲透系數(Papp)。

Ka= ( 1-CoutVout/ CinVin) Q/πr2L

Papp=-Q·ln( CoutVout/ CinVin)/2πrL

公式中Vin和Vout分別為腸道進、出口灌流液的體積(mL)，Cout和Cin為腸道進、出口灌流液中藥物的質量濃度(μg/mL)采用重量法計算。Q為體積流量(mL/min)，L和r分別為灌流腸段的長度(cm)和腸壁周長(cm)。

2.5 統(tǒng)計分析方法

3 結果

采用在體單向腸灌流對生川楝子提取物和炒川楝子提取物中川楝素在腸道中的吸收進行了考察，通過計算得其Ka、Papp值。有文獻報道表明Papp<3×10-6cm/s時藥物吸收較差，Papp>2×10-5cm/s時藥物吸收較好，二者之間藥物吸收中等[3-4]。結果表明，川楝子在腸道中的吸收較好。炒制前后川楝子提取物中川楝素在不同腸段中的吸收存在差異(P<0.05)，生品川楝子提取物中川楝素在十二指腸、空腸、回腸、結腸的吸收均大于炒品提取物。由此說明，川楝子炒制后可通過影響川楝子在腸道的吸收降低毒性。川楝素在不同腸段的吸收差異可能與四個腸段存在的載體和轉運蛋白不同有關[5]。結果見表1。

表1 炒制前后川楝子提取物中川楝素在大鼠不同腸段的Ka值和Papp值

注：與生品中川楝素相比，*P<0.05，**P<0.01

4 小結與討論

川楝素為三萜類成分，水溶性差，因此所以灌流液中需加入助溶劑以增加其溶解性。本研究對目前常用的助溶劑吐溫-80，十二烷基硫酸鈉，羧甲基纖維素鈉[6-9]的助溶效果進行了考察分析。經分析可知結果0.8%十二烷基硫酸鈉的助溶效果最好。此外，本研究預實驗尚對甲醇、乙腈兩種溶劑的復溶效果進行了考察，結果甲醇復溶得到的色譜峰峰形較乙腈好，因此本文選擇以甲醇為復溶劑。

實驗結果表明，川楝子的指標成分川楝素在腸道中的吸收良好，生川楝子和炒川楝子中川楝素在不同腸段存在吸收差異，說明川楝子炒制會影響川楝素的腸道吸收速率和藥物的表現滲透。川楝素在不同腸段的吸收情況存在差異，這可能與不同腸段存在酶的種類與數量的不同有關[10-11]。川楝子炒制后其吸收速率常數(Ka)和藥物表觀滲透系數(Papp)均顯著降低,這可能與川楝素的含量及其轉運機制有關，初步揭示了川楝子炒制減毒的機理。

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