蔣璟瑋，劉寶茹，梁丹丹，汪 威，羅 東，陳俊林，陳錦云，陳文直,2，王 嫣*

(1.重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學工程學重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤治療中心，重慶 400010)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種非造血類的成體多能干細胞，具有取材方便、增殖能力強、可多向分化、免疫原性低等特點[1]。組織損傷時，BMSCs可向受損位點遷移并進行修復，其對心肌梗死、神經(jīng)退行性疾病、骨疾病等疾病的治療作用已經(jīng)動物實驗證實[2-4]。然而，外源移植BMSCs在體內(nèi)遷移時，向靶組織的遷移率低[5-6]。如何提高外源性BMSCs自身遷移能力，從而使BMSCs在體內(nèi)向受損組織遷移時具有更強的能力，是目前干細胞治療領域亟待解決的難題。低強度脈沖超聲(low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)聲強范圍1～100 mW/cm2，目前臨床主要用于治療骨科疾病，具有費用低廉、簡便易行、效果理想的優(yōu)點[7-8]。LIPUS可促進BMSCs的增殖[9]及多向分化[10-12]，加快骨折愈合，從而達到治療目的[13]。本研究通過體外細胞實驗研究LIPUS對BMSCs遷移的影響，并篩選最佳聲強。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞培養(yǎng) BMSCs(購自中國科學院干細胞庫)來源于6周齡SD大鼠骨髓。將BMSCs從液態(tài)氮中取出后進行復蘇，加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum， FBS；Gibco公司)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，置于細胞培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。采用Olympus IX-70倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。當細胞生長至80%時，采用0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)消化傳代。

1.2 LIPUS輻照及分組 將處理后的BMSCs分為4組，在后續(xù)實驗中對空白對照組不進行LIPUS輻照(僅行假輻照操作)，對其余3組均采用海扶LIPUS儀樣機進行輻照，并根據(jù)輻照聲強分為30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組。其他超聲輻照參數(shù)：頻率0.3 MHz，重復頻率1 kHz，占空比20%，每次輻照時間20 min。

1.3 劃痕實驗 取生長狀態(tài)良好BMSCs，接種至六孔培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，每孔加入5×105個細胞，待細胞完全貼壁后采用無血清培養(yǎng)基“饑餓”培養(yǎng)24 h后，以 200 μl槍頭進行劃痕。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution， PBS)洗去劃掉的細胞，加入無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。而后分別對30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組進行輻照，并于輻照后即刻及輻照后24 h、48 h，采用Olympus IX-70倒置相差顯微鏡觀察劃痕區(qū)并進行拍照，通過image J軟件測定劃痕區(qū)面積。對空白對照組分別于相應時間測定劃痕區(qū)面積。消化收集各時間點BMSCs，離心后棄上清，加入1 ml新鮮完全培養(yǎng)基及0.5 ml濃度為1 mg/ml的MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴；Sigma公司]，于細胞孵箱中培養(yǎng)4 h，離心后棄去培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜(Sigma公司)溶解沉淀。采用Bio-Tek酶標儀在490 nm波長處測量吸光度值。

1.4 transwell小室模型構建及細胞遷移實驗 采用24孔濾膜孔徑8 μm的transwell小室(Corning公司)構建細胞遷移模型。實驗前將裝有含2% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基的transwell小室放入培養(yǎng)箱中平衡1 h。對BMSCs采用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，將細胞密度調(diào)整為5×105/ml，每孔200 μl接種于transwell小室的上室，并向transwell小室的下室內(nèi)加入800 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)基。接種后，對30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組進行輻照，24 h后取出transwell小室，以棉簽擦去上室未遷移的細胞，4%多聚甲醛固定，亞甲藍染液染色；對空白對照組僅于相應時間進行固定及染色處理。采用Olympus Ⅸ-70倒置相差顯微鏡隨機選取5個視野進行拍照并計數(shù)。

1.5 F-肌動蛋白(F-actin)染色 對30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組分別進行LIPUS輻照，爬片生長24 h后(密度達50%的匯合度)，吸棄培養(yǎng)液，與空白對照組共同以37℃預熱的PBS(pH為7.4)清洗細胞2次后，于室溫下采用4%多聚甲醛固定10 min，再以PBS清洗細胞2次，以Tritonx-100溶液透化處理5 min，取200 μl異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)標記的鬼筆環(huán)肽工作液(翊圣生物科技有限公司)進行染色，室溫下孵育30 min，以抗熒光淬滅封片劑(華邁科生物技術有限責任公司)封片。采用Nikon TE200熒光顯微鏡觀察F-actin表達情況，隨機選取5個視野進行拍照；采用image J軟件檢測各組細胞的相對熒光強度。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較多組間劃痕面積、吸光度、細胞計數(shù)及相對熒光強度，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 劃痕實驗及MTT活性檢測 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組LIPUS輻照后即刻、24 h及48 h及空白對照組相應時間劃痕面積見表1、圖1。輻照后24 h時空白對照組劃痕面積[(0.93±0.26) mm2]最大，分別大于30 mW/cm2組(P<0.001)、60 mW/cm2組(P<0.001)及90 mW/cm2組(P=0.015)；30 mW/cm2組劃痕面積最小[(0.47±0.21)mm2]，分別小于60 mW/cm2組(P<0.001)、90 mW/cm2組(P<0.001)及空白對照組(P<0.001)。輻照后48 h空白對照組劃痕面積[(0.70±0.11)mm2]仍明顯大于30 mW/cm2組(P<0.001)、60 mW/cm2組(P<0.001)和90 mW/cm2組(P<0.001)，30 mW/cm2組劃痕面積[(0.19±0.10)mm2]仍明顯小于60 mW/cm2組(P<0.001)、90 mW/cm2組(P<0.001)及空白對照組(P<0.001)。

表1 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組LIPUS輻照后不同時間及對照組相應時間BMSCs劃痕面積比較(mm2，±s)

表1 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組LIPUS輻照后不同時間及對照組相應時間BMSCs劃痕面積比較(mm2，±s)

組別輻照后即刻輻照后24 h輻照后48 h30 mW/cm2 組1.50±0.060.47±0.210.19±0.1060 mW/cm2 組1.53±0.030.70±0.250.49±0.1590 mW/cm2 組1.50±0.050.81±0.180.56±0.13空白對照組1.51±0.050.93±0.260.70±0.11F值2.92126.559106.110P值0.063<0.001<0.001

MTT活性檢測結(jié)果顯示，30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組LIPUS輻照后即刻、24 h及48 h及空白對照組相應時間吸光度差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組LIPUS輻照后不同時間及對照組相應時間BMSCs吸光度比較(±s)

表2 30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組LIPUS輻照后不同時間及對照組相應時間BMSCs吸光度比較(±s)

組別輻照后即刻輻照后24 h輻照后48 h30 mW/cm2 組1.77±0.152.01±0.122.40±0.1060 mW/cm2 組1.68±0.321.95±0.142.39±0.1590 mW/cm2 組1.71±0.221.96±0.132.40±0.15空白對照組1.67±0.251.96±0.112.44±0.08F值1.6160.7201.408P值0.1960.5440.378

2.2 transwell遷移結(jié)果 對穿過transwell小室上室的BMSCs進行染色(圖2)并計數(shù)結(jié)果顯示，各組間細胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(F=43.145，P<0.001)；兩兩比較，30 mW/cm2組[(212.53±35.32)個]、60 mW/cm2組[(168.87±35.49)個]及90 mW/cm2組[(155.60±35.34)個]細胞計數(shù)均大于空白對照組[(89.53±19.27)個；P均<0.001]，30 mW/cm2組細胞計數(shù)分別大于60 mW/cm2組(P=0.013)及90 mW/cm2組(P<0.001)，而60 mW/cm2組與60 mW/cm2組間細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.226)。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs劃痕愈合(×40) LIPUS輻照后即刻(A～D)、24 h(E～H)及48 h(I～L)30 mW/cm2組、60 mW/cm2組、90 mW/cm2組及空白對照組相應時間細胞劃痕圖像，藍線之間為劃痕區(qū)

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察穿過transwell小室上室的細胞，亞甲藍染色(×100) A.空白對照組； B.30 mW/cm2組； C.60 mW/cm2組； D.90 mW/cm2組 圖3 F-actin熒光顯微鏡下圖像，F(xiàn)ITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色(×100) A.空白對照組； B.30 mW/cm2 組； C.60 mW/cm2 組； D.90 mW/cm2 組

2.3 F-actin 染色結(jié)果 F-actin染色(圖3)顯示，LIPUS輻照后30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組BMSCs微絲增粗變長，數(shù)量增多。各組間相對熒光強度差異有統(tǒng)計學意義(F=64.350，P<0.001)。兩兩比較，30 mW/cm2組(125.43±17.43)、60 mW/cm2組[89.78±16.09]及90 mW/cm2組[73.54±13.04]相對熒光強度均高于空白對照組[(51.94±12.76)；P均<0.001]，30 mW/cm2組相對熒光強度高于60 mW/cm2組(P<0.001)及90 mW/cm2組(P<0.001)，60 mW/cm2組相對熒光強度高于90 mW/cm2組(P<0.001)。

3 討論

組織發(fā)生損傷時，BMSCs可向損傷位點歸巢并參與修復，此為BMSCs移植治療的理論基礎，而外源性注射的BMSCs在體內(nèi)遷移率低是目前BMSCs移植治療領域的瓶頸。研究[10]發(fā)現(xiàn)，LIPUS作用于BMSCs后，可對其生物學行為產(chǎn)生影響，但大多數(shù)研究[11-12]主要集中于LIPUS對BMSCs增殖能力和分化能力的影響。本研究探討LIPUS對BMSCs遷移能力的影響，并對LIPUS輻照的最佳聲強進行篩選。

BMSCs向組織損傷位點遷移是BMSCs治療的關鍵一步。劃痕模型可模仿體內(nèi)傷痕康復時細胞遷移過程，是細胞遷移研究的經(jīng)典模型。本研究采用不同聲強LIPUS對BMSCs劃痕進行輻照，發(fā)現(xiàn)LIPUS輻照后24 h及48 h時BMSCs劃痕面積均較相應時間未輻照者減小(圖1)，且超聲強度為30 mW/cm2時劃痕面積最小，表明LIPUS可增強BMSCs向“損傷”部位的遷移能力，且超聲強度為30 mW/cm2時增強作用最明顯。本研究通過MTT實驗對劃痕實驗中BMSCs的細胞增殖活性進行檢測結(jié)果顯示，各時間點4組BMSCs間吸光度差異均無統(tǒng)計學意義，表明各組增殖活性相似，劃痕面積的改變僅與細胞遷移能力有關。

為進一步確認LIPUS促進BMSCs遷移的作用，本研究進行transwell遷移實驗，發(fā)現(xiàn)分別以聲強為30 mW/cm2、60 mW/cm2、90 mW/cm2的LIPUS輻照后，傳過transwell小室上室的細胞計數(shù)均明顯高于未經(jīng)LIPUS輻照者，表明LIPUS可提高BMSCs的遷移能力，與Wei等[13]的研究結(jié)果一致。另有研究[14]報道，LIPUS聯(lián)合BMSCs移植可加速骨缺損愈合。組織損傷時通過LIPUS促進BMSCs動員，LIPUS不僅是促進BMSCs增殖和多向分化，而是在BMSCs歸巢這一步就開始發(fā)揮增效作用。

F-actin是構成微絲的主要細胞骨架蛋白，與細胞遷移能力密切相關。本研究以FITC-鬼筆環(huán)肽對LIPUS輻照后的BMSCs進行熒光染色，觀察其F-actin表達，發(fā)現(xiàn)LIPUS可使BMSCs的細胞骨架發(fā)生改變，微絲數(shù)量增多，細胞骨架面積增大，采用圖像分析軟件對各組F-actin熒光強度進行檢測后發(fā)現(xiàn)30 mW/cm2組、60 mW/cm2組及90 mW/cm2組的相對熒光強度均明顯高于空白對照組，且30 mW/cm2組明顯高于60 mW/cm2組及90 mW/cm2組，表明LIPUS可增強BMSCs的黏附和遷移能力，且30 mW/cm2的LIPUS輻照促進細胞遷移的能力最強。研究[15]發(fā)現(xiàn)，機械應力作用于細胞膜后可激活細胞膜上的一系列受體，將機械刺激信號傳遞至細胞內(nèi)，從而產(chǎn)生生物學效應改變。因此，LIPUS增強BMSCs遷移能力可能是由于超聲的機械應力作用于BMSCs細胞膜上的受體，再由細胞內(nèi)的信號分子將這種刺激傳遞至細胞骨架，使細胞骨架向利于細胞運動遷移的方向進行重排，從而促進細胞遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可促進BMSCs的體外遷移能力，超聲輻照最佳聲強為30 mW/cm2。但本研究僅對BMSCs的體外遷移能力進行了檢測，其在實驗動物及人體內(nèi)是否具有相同的生物效應還需要進一步研究證實。

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