周天嬌，李春燕,2，韓莉萍，李亞娟，吳艷芳*(．新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，河南 新鄉(xiāng) 453002；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院 藥學綜合實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

尾葉香茶菜Rabdosiaexcise(Maxim.)Hara屬于唇形科香茶菜屬的植物，全草入藥，性涼、味甘，具有清熱解毒、抗菌消炎、活血化瘀的功效。尾葉香茶菜主要含有萜類、黃酮類和揮發(fā)油等成分，其中萜類主要是對映-貝殼杉烷型二萜化合物，具有良好的抗腫瘤作用[1-4]。超聲輔助提取可提高有效成分的提取速度和提取效率[5-6]，目前,此方法對二萜類化合物的提取有先例，但其影響因素并不齊全，本研究通過單因素試驗和響應面試驗多方面考察超聲輔助提取尾葉香茶菜中二萜成分的提取工藝[7-13]，研究最佳的提取工藝條件，探索一種簡便、快速、效率高的提取方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

尾葉香茶菜(2012年8月采集于吉林省磐石市，植物標本存在新鄉(xiāng)醫(yī)學院中藥學標本館)，對照化合物Kamebakaurin(從尾葉香茶菜中提取分離所得，純度98%以上)，無水乙醇(分析純)，蒸餾水(自制)。

KQ-600KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)臺式低速自動平衡離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，L400)，電子天平(十萬分之一，萬分之一，XS205型，瑞士Mettler Toledo公司)，TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1 標準品溶液的制備

取尾葉香茶菜二萜類化合物Kamebakaurin對照品適量， 精密稱定，加70%乙醇溶解并制成每1 mL中含Kamebakaurin約0.2 mg的溶液，作對照品儲備液，在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品溶液的制備

取樣品提取液0.1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，以同樣的方法在235 nm處測定其吸光度A，按回歸方程計算總二萜含量。

2 結(jié)果和討論

2.1 方法學研究

2.1.1 測定波長的選擇

取對照品溶液，以70%乙醇為空白對照，在200～700 nm范圍內(nèi)進行掃描，在235 nm處有最大吸收，故選取235 nm為檢測波長。

2.1.2 標準曲線的繪制

取對照品儲備液，搖勻，分別精密量取0.50，0.60，0.80，1.00，1.50 mL置于10 mL容量瓶中，并用70%乙醇定容至刻度，搖勻，分別依法進樣測定，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，計算線性回歸方程為Y=22.446×-0.0088,r2=0.999 7，結(jié)果表明， Kamebakaurin在0.010～0.030 mg·mL-1范圍內(nèi)呈很好的線性關系。

2.1.3 精密度試驗考察

取樣品A3連續(xù)測定5次，記錄吸光度值，RSD為0.77%，表明本方法精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗考察

將樣品A3每隔10 min測定一次吸光度，連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，RSD為2.46%，表明樣品溶液在1 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率

精密稱取已知總二萜含量的尾葉香茶菜0.5 g，共6份，分別加入約0.05 g對照品，測定吸光度計算加樣回收率，平均回收率為100.40%，RSD為2.13%。

方法學試驗結(jié)果表明，采用紫外分光光度法測定尾葉香茶菜總二萜含量，重現(xiàn)性好，簡單方便，穩(wěn)定可靠。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 單因素試驗

分別以乙醇濃度、超聲提取時間、溫度和功率為主要因素來進行單因素試驗，乙醇濃度分別考察了50%，60%，70%，80%，90%，95%的乙醇、提取時間分別考察了10，20，30，40，50，60 min的超聲提取時間、提取溫度分別考察了30，40，50，60，70℃的超聲提取溫度、功率分別考察了300，360，420，480，540 W的超聲提取功率，以上樣品的提取液以3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液按“1.2.2樣品溶液的制備”測定吸光度，試驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，在乙醇濃度為60%時二萜類化合物的提取效率最高，故乙醇濃度控制在50%～70%為佳；二萜含量隨著提取時間的增加而增加，考慮到試驗效率，提取時間在20 min后，總二萜的含量相差不大，故提取時間選取20 min；提取溫度在50℃時總二萜的提取效率最高，故溫度條件控制在30～60℃為佳；隨著提取功率的增加，提取效率不斷地上升，其中在300～420 W之間提取效率增加幅度最大，考慮經(jīng)濟因素和成本因素，超聲功率選擇300～420 W為佳，研究結(jié)果表明最佳提取工藝為60%乙醇濃度、使用300～420 W的超聲功率在50℃提取20 min。

圖1 尾葉香茶菜總二萜提取單因素試驗結(jié)果

2.2.2 響應面試驗

依據(jù)Box-Behnken的設計原理[14]，再根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定提取時間設定為20 min，如表1以乙醇濃度、提取溫度、超聲功率三因素作為自變量，總二萜提取含量比率為響應值，設計3因素3水平一共17個試驗點的響應面試驗。采用Design-Exipert軟件對表1數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表2，使用二次多項式回歸，擬合得到總二萜含量對3個因素功率(A)、溫度(B)、乙醇濃度(C)的二次多項式方程為：

Y=-36.58+0.03A+0.27B+0.83C-1.52×10-4AB+6.20×10-4AC-3.94×10-4BC-8.05×10-5A2-1.33×10-3B2-8.24×10-3C2

表1 尾葉香茶菜總二萜提取響應面試驗結(jié)果

由表2可知，P=0.011 8，說明該模型方程顯著，失擬項的P=0.8927，意味著失擬項不顯著；由表2可知，B(溫度)是極顯著性因素(P=0.0008)，C和C2是顯著因素(P<0.05)，表明C(乙醇濃度)對提取二萜類化合物的影響不是簡單的線性關系。超聲功率對二萜類成分提取影響不顯著(P>0.05)。由圖2可知，二萜類化合物含量隨溫度的升高而增加，隨著乙醇濃度的增加而增加，當溫度為60℃和乙醇濃度為64.13%時，到達最大值。R2=0.890 5，說明了該模型能夠解釋89.05%響應值的變化。adjR2與 Pred R2值相差不大，表明該響應面方程不需要再做進一步的優(yōu)化。

表2 響應面試驗提取總二萜的含量方差分析結(jié)果

注：R2=0.890 8；adj R2=0.750 3；Pred R2=0.625 3；*P<0.05，**P<0.01

圖2 提取溫度和乙醇濃度對二萜類類物質(zhì)提取率的響應面和等高線圖

通過軟件分析Y最大時，A=397.75，B=60.00，C=64.13，考慮可行性，結(jié)果修正為功率400 W，溫度60℃，乙醇濃度64%。為了驗證試驗結(jié)果的可靠性，以最優(yōu)條件進行3次驗證試驗，計算尾葉香茶菜總二萜含量，求得平均值為5.48%，而預測總二萜的含量為5.54%，實際值與預測值較為接近，驗證了所建立的模型的正確性，也說明了響應面的分析方法適合于尾葉香茶菜中總二萜的超聲輔助提取工藝的優(yōu)化。

3 結(jié)論

本文研究了超聲輔助提取尾葉香茶菜總二萜工藝的優(yōu)化。含量測定中以Kamebakaurin作為對照品，采用紫外分光光度法來測定尾葉香茶菜中總二萜的含量，方法學試驗結(jié)果表明，采用紫外分光光度法測定尾葉香茶菜總二萜含量，重現(xiàn)性好，簡單方便，穩(wěn)定可靠。

單因素試驗分別以乙醇濃度、超聲提取時間、溫度和功率為主要因素來進行單因素試驗，通過比較總二萜的提取率確定了最佳提取工藝的乙醇濃度、超聲功率、提取溫度和時間。在單因素試驗結(jié)果的基礎上，依據(jù)Box-Behnken的設計原理，使用響應面設計方法，以乙醇濃度、提取溫度、超聲功率三因素作為自變量，總二萜提取含量比率為響應值，設計3因素3水平一共17個試驗點的響應面分析試驗，并使用二次多項式回歸建立響應面方程對提取工藝進行篩選和優(yōu)化，最終確立其最佳的提取條件為：功率400 W，溫度60℃，乙醇濃度64%。本法可節(jié)省時間和溶劑，生產(chǎn)成本也較低，建立一個提取二萜化合物的工藝流程，為開發(fā)利用此資源提供了另一條途徑。

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