秦亞梅,張文信(渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西渭南714026)
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種涉及多個滑膜關(guān)節(jié)的,漸進(jìn)的骨組織和軟骨破壞的自身免疫性疾病[1]。Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型被認(rèn)為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典動物模型,較廣泛地用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)通過CIA來研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用,現(xiàn)具體報(bào)道如下。
1.1 動物 健康清潔級SD大鼠50只,雌雄各半,體重(200±20)g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號:SCXK(陜)2007?001。
1.2 方法
1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取及制備 采用頸椎脫臼法處死大鼠,無菌操作下,取出雙側(cè)股骨、脛骨,自骨中段剪斷,反復(fù)沖洗兩干骺端骨髓,收集骨髓沖洗液,離心后棄去上清液,重懸沉淀物,接種到培養(yǎng)瓶中,5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞達(dá)80%~90%融合時進(jìn)行傳代,以一傳三的比例傳代。將第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞收獲制成1.0×106mL?1細(xì)胞懸液以備移植用。
1.2.2 造模 參照文獻(xiàn)[2?3],改進(jìn)造模方法。將牛Ⅱ型膠原溶液與等體積完全弗氏佐劑充分乳化制成含牛Ⅱ型膠原1.0 mg/mL的乳化液。在大鼠的右后肢足跖皮內(nèi)皮下注射乳化液0.1 mL。7 d后,在大鼠尾、背部多點(diǎn)皮下注射乳化液0.1 mL。
1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組、治療方式及標(biāo)本采集 將造模成功的CIA大鼠隨機(jī)分為模型組、干細(xì)胞組、潑尼松組,每組10只,正常組10只。正常組和造模組不做處理。干細(xì)胞組通過尾靜脈給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植,每只0.5 mL。潑尼松組給予含醋酸潑尼松的生理鹽水(0.4 mg/mL)0.5 mL灌服,每天1次。治療4周后麻醉,腹主動脈取血,收取血清,采用酶聯(lián)免疫吸附測定法對白細(xì)胞介素 17(IL?17)、IL?6 進(jìn)行檢測。
1.2.4 關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評分 每周1次對關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)[4]如下。0分:無紅腫;1分:小趾關(guān)節(jié)紅腫;2分:趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪腫脹。
1.2.5 大鼠后肢的足腫脹度測量 應(yīng)用足容積測定儀測定,以大鼠雙后肢的足容積量作為足腫脹的指標(biāo)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以±s表示,采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組大鼠足腫脹度的變化 與正常組相比,模型組足腫脹度明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,干細(xì)胞組、潑尼松組足腫脹度降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與干細(xì)胞組相比,潑尼松組足腫脹度降低顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 各組大鼠足腫脹度的變化比較(±s,mL)
表1 各組大鼠足腫脹度的變化比較(±s,mL)
注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與干細(xì)胞組比較,cP<0.05
第28天2.1±0.52.7±0.7a 2.5±0.4b 2.4±0.5bc組別正常組模型組干細(xì)胞組潑尼松組n 10101010第7天1.9±0.32.7±0.4a 2.6±0.8b 2.5±0.7bc第14天2.0±0.42.9±0.3a 2.7±0.5b 2.6±0.2bc第21天2.0±0.22.8±0.6a 2.6±0.3b 2.4±0.3bc
2.2 各組大鼠AI評分的變化 與正常組相比,模型組AI評分明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,干細(xì)胞組、潑尼松組AI評分降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與干細(xì)胞組相比,潑尼松組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分降低顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
表2 各組大鼠AI評分的變化(±s,分)
表2 各組大鼠AI評分的變化(±s,分)
注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與干細(xì)胞組比較,cP<0.05
第28天06.8±1.5a 5.8±1.9b 4.7±1.4bc組別正常組模型組干細(xì)胞組潑尼松組n 10101010第7天08.1±1.7a 7.6±1.8b 6.4±0.2bc第14天08.4±2.2a 7.7±2.1b 6.5±1.6bc第21天07.6±1.4a 6.7±1.3b 5.4±1.3bc
2.3 各組大鼠IL?17、IL?6水平比較 與正常組相比,模型組IL?17、IL?6水平升高;與模型組相比,干細(xì)胞組、潑尼松組IL?17、IL?6水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與干細(xì)胞組相比,潑尼松組 IL?17、IL?6 降低顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
表3 各組大鼠IL?17、IL?6水平比較(±s,pg/mL)
表3 各組大鼠IL?17、IL?6水平比較(±s,pg/mL)
注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與干細(xì)胞組比較,cP<0.05
IL?6170.6±33.2365.3±46.7a 213.5±34.9b 185.6±43.5bc組別正常組模型組干細(xì)胞組潑尼松組n 10101010 IL?17150.6±63.5265.3±35.8a 204.3±54.8b 155.4±53.7bc
CIA引起關(guān)節(jié)的癥狀及病理與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎非常相似[5]。間充質(zhì)干細(xì)胞主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,其中骨髓組織含量最為豐富。研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[6]。IL?17是非常重要的促炎性細(xì)胞因子,可以損傷細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)破骨細(xì)胞活化,使骨損傷加重[7],還能與其他細(xì)胞因子相互作用,促進(jìn)血管翳的形成,導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)一步發(fā)展,在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病程發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8?9]。IL?6 也是重要的促炎性細(xì)胞因子,能誘導(dǎo) B 細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體,并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化,參與機(jī)體的免疫應(yīng)答,是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑,在炎癥早期發(fā)揮重要促炎作用[10]。
本實(shí)驗(yàn)說明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度,降低AI評分,降低IL?17、IL?6水平,具有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。雖然治療作用沒有潑尼松顯著,但是,激素長期應(yīng)用不良反應(yīng)較多。因此,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎上具有很大的潛力和可行性,并有其他藥物無法替代的優(yōu)越性,是一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的新方法,值得進(jìn)一步研究。
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