尹曉丹，王景尚，何軍琴，薛曉鷗

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，北京 100026；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700）

薄型子宮內(nèi)膜是指子宮內(nèi)膜厚度低于能夠獲得妊娠的閾厚度，即小于7 mm[1]。近年來(lái)研究表明，子宮內(nèi)膜中存在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，其是一類(lèi)可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生的細(xì)胞[2-4]，是具有自我更新以及增殖能力的細(xì)胞。隨著研究不斷深入，有學(xué)者認(rèn)為，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞有可能成為治療薄型子宮內(nèi)膜的手段[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一個(gè)保守的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)，在胚胎發(fā)育、維持器官及組織穩(wěn)態(tài)方面，發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，并且與薄型子宮內(nèi)膜的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，該通路激活后使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚，是Wnt的活性調(diào)控信號(hào)通路的關(guān)鍵[6]。多項(xiàng)研究亦表明，Oct4、ABCG2是胚胎干細(xì)胞的重要標(biāo)記物[7-8]。因此，β-catenin、Oct4、ABCG2雖然并非子宮內(nèi)膜干細(xì)胞特有，但能夠反映子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的特性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雌性，200～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物適應(yīng)3天環(huán)境，自由飲水飲食，室溫（22±1）℃，濕度（40±10）%，光照周期12/12 h。

1.2 藥品 實(shí)驗(yàn)用中藥材，購(gòu)自同仁堂藥店。補(bǔ)腎活血方由熟地15 g，菟絲子12 g，桑寄生12 g，覆盆子12 g，續(xù)斷12 g，川牛膝12 g，當(dāng)歸12 g，丹參12 g，澤蘭12 g，川芎9 g，益母草20 g，雞血藤12 g，紅花9 g組成，按人鼠體表面積換算，大鼠劑量為人的等效劑量。戊酸雌二醇，1 mg/片，拜耳公司，批號(hào)：J20130009，按人鼠體表面積換算，大鼠計(jì)量為0.3 mg/（kg·d），羥基脲，齊魯制藥有限公司，批號(hào)H37021289，按人鼠體表面積換算，大鼠計(jì)量為450 mg/（kg·d），高分子右旋糖苷，Dextran70，瑞士Amwesham Biosciences公司，按人鼠體表面積換算，大鼠計(jì)量為5 mL/kg。

1.3 主要試劑 β-catenin一抗、ABCG2一抗（購(gòu)自Abcam公司），生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒（均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.4 動(dòng)物分組及用藥 將大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只：正常對(duì)照組，灌服蒸餾水；模型組，腎虛血瘀薄型子宮內(nèi)膜模型建立后，灌服蒸餾水；補(bǔ)佳樂(lè)模型組，模型組基礎(chǔ)上，灌服補(bǔ)佳樂(lè)0.3 mg/（kg·d）；補(bǔ)腎活血高劑量組，模型組基礎(chǔ)上，灌服補(bǔ)腎活血中藥8.64 mg/kg；補(bǔ)腎活血中劑量組，模型組基礎(chǔ)上，灌服補(bǔ)腎活血中藥4.32 mg/kg；補(bǔ)腎活血低劑量組，模型組基礎(chǔ)上，灌服補(bǔ)腎活血中藥2.16 mg/kg。

1.5 動(dòng)物模型制備 腎虛血瘀模型：參照林繼紅，楊海英等《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》建立腎虛血瘀型大鼠模型。大鼠采用羥基脲450 mg/（kg·d）給大鼠灌胃，于實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥30 min后尾靜脈快速推注10%高分子右旋糖苷5 mL/kg。給羥基脲8 d后，發(fā)現(xiàn)大鼠皮毛枯槁欠光澤，體型瘦小等腎虛癥狀；注射高分子右旋糖苷后觀察發(fā)現(xiàn)大鼠耳、爪、尾部顏色紫暗，提示有血瘀，從而造成腎虛血瘀模型。將腎虛血瘀模型大鼠腹部切開(kāi)皮膚進(jìn)入腹腔，定位子宮后，在宮角處注入0.3 mL95%無(wú)水乙醇，保持宮腔充盈狀態(tài)，2 min后再次注藥，重復(fù)此操作，另一側(cè)操作相同，反復(fù)沖洗宮腔，關(guān)腹。最終造成腎虛血瘀薄型子宮內(nèi)膜模型。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)活化β-catenin蛋白 將標(biāo)本固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，連續(xù)切片。免疫化學(xué)染色采用SABC法，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。將切片滴加正常山羊血清。滴加活性β-catenin抗體（濃度1:300），置于4 ℃冰箱過(guò)夜。蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化、脫水、封片。每張切片在子宮內(nèi)膜層隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件系統(tǒng)，計(jì)算每組標(biāo)本切片中平均光密度值（IOD）。

1.6.2 RT-PRC檢測(cè)Oct4基因表達(dá) 采用RNA提取試劑盒，提取子宮內(nèi)膜干細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用Quant逆轉(zhuǎn)錄酶，在37 ℃1 h反映條件下，逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Oct4在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞中基因表達(dá)情況。

1.6.3 Wertern blot法檢測(cè)ABCG2蛋白的表達(dá) 首先提取總蛋白，BCA方法檢測(cè)蛋白濃度，按照濕法電轉(zhuǎn)印方法操作，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以Tubulin作為對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎活血中藥對(duì)薄型子宮內(nèi)膜大鼠活化β-catenin蛋白影響 模型組較對(duì)照組極顯著降低（P＜0.001）；給藥后各組β-catenin不同程度增加；低劑量組較模型組有顯著性差異（P＜0.05）；中劑量組，高劑量組，補(bǔ)佳樂(lè)組與模型組有極顯著性差異（P＜0.001），見(jiàn)表1、圖1。

2.2 補(bǔ)腎活血中藥對(duì)薄型子宮內(nèi)膜大鼠活化Oct基因影響 模型組較對(duì)照組極顯著降低（P＜0.001）；給藥后各組OCT4表達(dá)量不同程度增加；其中低劑量、中劑量與模型組無(wú)顯著性差異；高劑量與模型組有極顯著性差異（P＜0.001）；補(bǔ)佳樂(lè)組與模型組有顯著性差異（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 補(bǔ)腎活血中藥對(duì)薄型子宮內(nèi)膜大鼠活化β-catenin蛋白影響

圖1 各組薄型子宮內(nèi)膜大鼠活化β-catenin蛋白，X100

表2 補(bǔ)腎活血中藥對(duì)薄型子宮內(nèi)膜大鼠OCT4mRNA表達(dá)量的影響

2.3 補(bǔ)腎活血中藥對(duì)薄型子宮內(nèi)膜大鼠ABCG2蛋白影響 見(jiàn)表3、圖3。

表3 補(bǔ)腎活血中藥對(duì)薄型子宮內(nèi)膜大鼠ABCG2蛋白表達(dá)量的影響

圖3 各組薄型子宮內(nèi)膜大鼠ABCG2蛋白檢測(cè)

3 討論

早在1978年，Prianishnikov[9]就提出子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的假設(shè)，并認(rèn)為子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可修復(fù)子宮內(nèi)膜。然而，子宮內(nèi)膜在修復(fù)過(guò)程中易受到不良因素影響從而導(dǎo)致薄型子宮內(nèi)膜等內(nèi)膜疾病[10]，這類(lèi)疾病可能與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞不足有關(guān)[11]。目前，已有大量的臨床基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血類(lèi)中藥能改善子宮內(nèi)膜環(huán)境，增加子宮內(nèi)膜的容受性[12-15]。補(bǔ)腎活血中藥不僅對(duì)子宮內(nèi)膜疾病有治療作用，而且有學(xué)者將補(bǔ)腎活血大法用于治療其他婦科疾病也有較好的療效[16-18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血中藥可以增加子宮內(nèi)膜干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物OCT4基因、ABCG2蛋白的表達(dá)，由此推測(cè)補(bǔ)腎活血中藥可能是通過(guò)增加子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的表達(dá)來(lái)治療薄型子宮內(nèi)膜的[19-20]。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血中藥作用后活化β-catenin蛋白的表達(dá)增加，而β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路調(diào)控的關(guān)鍵，因此，我們推測(cè)補(bǔ)腎活血中藥是不是通過(guò)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)而干預(yù)了子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的表達(dá)，這種推測(cè)將在進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探討。

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