巫小莉 ，張玲 ，肖鴻岸 ，陳倩禮 ，周碧云

(1、廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣州51000；2、廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院，廣州510168)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 Sysmex XN－1000全自動(dòng)血液分析儀；配套試劑；校準(zhǔn)物名稱：XN－CAL，批號(hào)：63130525、 質(zhì) 控 物 批 號(hào) ：63611101、63611102、63611103；廣州陽(yáng)普科技醫(yī)療股份有限公司：2mg/ml EDTA－K2抗凝管：批號(hào) 161119；20IU/ml肝素鋰抗凝管： 批號(hào)：161010；3.8%枸櫞酸鈉抗凝管：批號(hào)：170119；奧林巴斯BX－43雙目顯微鏡；貝索企業(yè)：瑞氏－姬姆薩染液；

1.1.2 標(biāo)本來(lái)源 新鮮血標(biāo)本來(lái)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院門診病人及健康體檢者。

1.2 方法

1.2.1 儀器的準(zhǔn)備 按 《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T406－2012》臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目校準(zhǔn)操作要求進(jìn)行校準(zhǔn)。各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 質(zhì)控 每天質(zhì)控（高、中、低）數(shù)據(jù)均在±2SD范圍之內(nèi)；

1.2.3 標(biāo)本選取 本院近三個(gè)月內(nèi)沒(méi)有用過(guò)肝素或其他抗凝治療的臨床標(biāo)本共102例，其中82例用于EDTA－K2與肝素抗凝血的血小板計(jì)數(shù)比對(duì)；20例體檢標(biāo)本用于不同濃度肝素的血小板計(jì)數(shù)及MPV的比對(duì)。同步進(jìn)行涂片染色顯微鏡觀察。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)操作 每例同時(shí)抽血3管：2mg/ml EDTA－K22ml、20IU/ml肝素鋰管抽血 5ml、50IU/ml肝素鋰管抽血2ml，分別進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，同步涂片觀察血小板分布情況。試驗(yàn)于抽血后15min開(kāi)始，兩小時(shí)內(nèi)同步完成測(cè)試。

1.2.5 正常人的枸櫞酸鈉抗凝血2管，1000rpm離心5min，吸取富含血小板血漿（PRP），其中一管加入肝素，另一管不加肝素，混勻放置數(shù)分鐘后分別涂片染色，在鏡下觀察血小板分布情況。

西芳寺原是作為圣德太子別墅而建的寺院，于1339年重建為禪宗寺院，是日本最古老的庭園之一，也是日本枯山水庭園的開(kāi)山之作，由日本枯山水鼻祖、禪學(xué)國(guó)師夢(mèng)窗疏石設(shè)計(jì)建造而成，融合了禪宗中幽玄、素樸、自然、清靜等理念，已被列入世界文化遺產(chǎn)。日本的枯山水園林即由細(xì)沙碎石鋪地，表示“水”，一些疊放有致的石塊表示“山”，再添加苔蘚、草坪或其他自然元素，以此組成的縮微式園林景觀。西芳寺滿園生長(zhǎng)有100多種苔蘚植物，庭園分為上、下兩段，上段庭園為枯山水園林，下段為平地的池泉回游式庭園。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用 SPSS 13.0軟件包統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 82例EDTA－K2抗凝血與肝素鋰抗凝血的血小板計(jì)數(shù)，肝素鋰抗凝血的血小板數(shù)明顯低于EDTA－K2抗凝血的血小板數(shù)，有非常顯著性差異，P＜0.01。數(shù)據(jù)顯示，肝素鋰抗凝的血小板計(jì)數(shù)量的下降速度存在個(gè)體差異，不同個(gè)體的血小板出現(xiàn)不同的聚集狀，有簇狀、小簇狀、大簇狀，甚至成堆聚集。見(jiàn)圖1、表1。

表1 EDTA-K2抗凝血與肝素鋰抗凝血血小板計(jì)數(shù)比較

圖1 EDTA與不同濃度肝素抗凝血血小板鏡下分布圖（×1000）

2.2 20例不同濃度肝素抗凝血 20IU/ml肝素鋰管和50IU/ml肝素鋰管的血小板計(jì)數(shù)，高濃度肝素血小板數(shù)明顯減少，有非常顯著性差異（P＜0.01）。 見(jiàn)表2。

表2 不同濃度肝素抗凝血血小板計(jì)數(shù)比較

圖2 EDTA、肝素20IU與肝素50IU血小板計(jì)數(shù)比對(duì)（誤差條形圖：95%CI）

2.3 20例體檢標(biāo)本中，肝素抗凝的MPV較EDTAK2抗凝大，50IU/ml肝素抗凝的MPV較20IU/ml肝素抗凝大，肝素濃度越高M(jìn)PV越大，呈正相關(guān)，鏡下觀察血小板有腫脹現(xiàn)象，統(tǒng)計(jì)學(xué)有非常顯著性意義（P＜0.01）。 見(jiàn)表 3。

表3 EDTA-K2抗凝血與不同濃度肝素鋰抗凝血MPV比較

2.4 兩管富含血小板血漿（PRP），一管加入肝素，另一管不加肝素，混勻放置數(shù)分鐘后分別涂片染色，在鏡下觀察血小板分布情況，加入肝素的那一管血小板有聚集現(xiàn)象，見(jiàn)圖3。不加肝素的那管血小板呈星狀散在分布，見(jiàn)圖4。

圖3 PRP（有肝素）（×1000） 圖4 PRP（無(wú)肝素）（×1000）

3 討論

在體外，肝素可以誘導(dǎo)血小板聚集。表1結(jié)果顯示：同一條件下，EDTA－K2抗凝血與肝素抗凝血的血小板計(jì)數(shù)有非常顯著性意義，P＜0.001。圖1示顯微鏡下，肝素抗凝血涂片可見(jiàn)血小板聚集呈小簇狀、大簇狀或成堆分布，而EDTA－K2抗凝血的血小板呈星狀分布。表2結(jié)果顯示，高濃度肝素抗凝血的血小板計(jì)數(shù)降低幅度較低濃度肝素的明顯，兩者血小板計(jì)數(shù)有非常顯著性意義，P＜0.01；臨床亦有報(bào)導(dǎo)接受肝素治療的患者，嚴(yán)重出血與治療劑量之間有明顯關(guān)系，接受5mg和10mg劑量的患者出血事件的發(fā)生率均較高，接受最小劑量2.5mg的患者，出血發(fā)生率低于隨機(jī)接受華法林的患者(P=0.029)[11－14]，說(shuō)明不論體外試驗(yàn)或體內(nèi)治療，均受肝素濃度的影響。

為了確定肝素有無(wú)誘導(dǎo)血小板聚集的作用，研究小組進(jìn)行了補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)：采集正常人的枸櫞酸鈉抗凝血2管，1000rpm離心5min，吸取富含血小板血漿（PRP），其中一管加入肝素，混勻放置數(shù)分鐘后分別涂片染色，在鏡下觀察血小板分布情況，結(jié)果顯示，加入肝素后血小板有聚集現(xiàn)象，見(jiàn)圖3；不加肝素的血小板則呈散在的星狀分布，見(jiàn)圖4，結(jié)論：肝素可在體外誘導(dǎo)血小板聚集。而Williams等的研究表明普通肝素可以直接激活血小板，增加血小板的聚集力[17]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

此外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和在顯微鏡下觀察到的血小板聚集的情況顯示，即使同劑量的肝素抗凝血樣本在顯微鏡下觀察，有的血小板聚集成大簇狀，甚至聚集成堆，有的樣本則形成小簇狀聚集。數(shù)據(jù)方面也是一樣，有些變化很大，有些則沒(méi)太大的變化，可能是因?yàn)楦嗡貛в胸?fù)電荷可以與各種血漿蛋白結(jié)合，不同水平的蛋白可導(dǎo)致肝素的不同效果差別[2－18]。

根據(jù)文獻(xiàn)描述，體內(nèi)肝素誘導(dǎo)血小板聚集應(yīng)屬于非免疫性結(jié)合，肝素與血小板第四因子（PF4）結(jié)合是目前普遍接受的可能原因。臨床上肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥（HIT）分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型較常見(jiàn)，原因不明，是一種良性的非免疫反應(yīng)，可能與肝素直接激活血小板相關(guān)。[10－13]。肝素體內(nèi)發(fā)生的Ⅰ型反應(yīng)與直接激活血小板相關(guān)，而肝素體外誘導(dǎo)血小板聚集，也是肝素直接激活血小板而發(fā)生，兩者之間是否存在關(guān)聯(lián)性值得探討。

英國(guó)血小板輸血指南中明確指出肝素引起的免疫性血小板減少癥是血小板輸注禁忌證，即真正的HIT是不能通過(guò)輸注血小板治療的，因其反饋機(jī)制會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的血栓栓塞并發(fā)癥[11]。假設(shè)肝素引起的免疫性血小板減少癥并不是真正的血小板減少，而是血小板發(fā)生聚集造成的假性減少，此時(shí)如果輸注血小板會(huì)加速血小板聚集，導(dǎo)致嚴(yán)重的微循環(huán)血栓栓塞。假設(shè)是否成立，需待進(jìn)一步做相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

血透患者維持性血液透析(Maintenance haemodialysis，MHD)由于需要反復(fù)高頻次的使用肝素，因此更具有發(fā)生HIT的風(fēng)險(xiǎn)[3]。更有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)：約38%～78%HIT患者形成血栓，其中截肢10%，20%～30%的患者一個(gè)月內(nèi)死亡[12]。血液透析過(guò)程與肝素體外誘導(dǎo)血小板聚集試驗(yàn)具有相似性，體內(nèi)肝素治療后引起血小板的一系列反應(yīng)或許與肝素在體外能誘導(dǎo)血小板聚集有相關(guān)，問(wèn)題值得進(jìn)一步思考和研究。當(dāng)然，體外試驗(yàn)用的是普通肝素，而體內(nèi)治療用的是低分子肝素，兩者作用不能相提并論，我們可以從中得到啟示。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與大量的臨床資料說(shuō)明，肝素在體外、體內(nèi)均可誘導(dǎo)血小板聚集。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)的啟示，有必要對(duì)肝素抗凝原理進(jìn)行重新認(rèn)識(shí)和探討。

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