卓樂盈，吳鎮(zhèn)杰，于祥，周美茜，李成業(yè)，歐陽金生，林琪斌，蔡暢

（1.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035；2.永嘉縣中醫(yī)院 呼吸科，浙江 溫州 325105；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 呼吸科，浙江 溫州 325015）

氣道慢性炎癥是大多數(shù)呼吸道疾病的重要臨床病理生理特征。近年來，隨著環(huán)境污染的逐漸加重，氣道慢性炎癥性疾病的發(fā)生率逐年增長。人體氣道與外界環(huán)境相通，直接接觸各種氧化劑和毒性物質、吸入性過敏原、病原微生物以及空氣污染物等，均可通過不同的機制激發(fā)炎癥反應。

脂氧素（lipoxins，LXs）是一種重要的內源性脂質抗炎介質，能夠促進炎癥反應的及時消退，被譽為炎癥反應的“剎車信號”或“停止信號”[1]。研究發(fā)現(xiàn)LXA4及其類似物在小鼠哮喘模型中具有抑制炎癥及促進炎癥消退的作用，包括增強自然殺傷細胞功能，刺激巨噬細胞表達CD206[2]，還可以促進肺損傷的修復[3]。但目前LXs在氣道炎癥進程中參與的信號通路及其分子調控機制尚未完全清楚。本研究通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激BEAS-2B細胞，探討LXA4對氣道炎癥反應的抑制作用及其所涉及的信號通路。

1 材料和方法

1.1 材料 BEAS-2B細胞株購自中國醫(yī)學科學院昆明細胞庫。LPS、Trizol和DCFH-DA試劑購于美國Sigma公司；LXA4購自美國Cayman Chemical公司；BEGM培養(yǎng)基購自美國Lonza公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；谷胱甘肽（Glutathione，GSH）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒、細胞漿和細胞核蛋白抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；人p38、p-p38抗體購自美國Cell Signal Technology公司；人核因子E2相關因子（nuclear factor erythroidderived 2-like 2，Nrf2）、p-Nrf2、核纖層蛋白B1（Lamin B1）抗體購自美國Abcam公司；人β-tubulin抗體購自杭州聯(lián)科生物公司；SYBR Green realtime PCR Master Mix、反轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒購自日本Takara公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制：LPS配成貯存濃度為100μg/mL 的溶液，分裝后-20℃保存；為保持試劑穩(wěn)定性，LXA4用無菌無水乙醇溶解，配成貯存濃度為100 μmol/L 的溶液，分裝后-80℃保存?zhèn)溆?，使用時取適量溶液，待無水乙醇蒸發(fā)完畢后，加入培養(yǎng)基重新溶解。

1.2.2 BEAS-2B細胞培養(yǎng)：BEAS-2B細胞培養(yǎng)于BEGM培養(yǎng)基，按1×105個細胞/mL密度接種到培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，BEAS-2B細胞為貼壁生長，細胞匯集至70%～80%時，按1:3傳代。

1.2.3 實驗分組及干預：將對數(shù)期生長的BEAS-2B細胞分為3組。對照組：不做任何處理；LPS組：100 ng/mL LPS刺激24h；LPS+LXA4組：100 nmol/L LXA4預處理30min，加入100 ng/mL LPS刺激24h。收集細胞或培養(yǎng)上清進行后續(xù)實驗。

1.2.4 實時熒光定量PCR：以Trizol法提取各組細胞總RNA，并測定RNA濃度及純度（2.0＞A260/A280＞1.8）。按照反轉錄試劑盒操作說明將RNA反轉錄為cDNA。取cDNA產(chǎn)物用SYBR Green real-time PCR Master Mix進行實時熒光定量PCR，每個樣本設3個復孔。采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)處理，計算實驗組相對于對照組的基因表達倍數(shù)變化。IL-1β上游引物序列：5’-CCAGGAGAATGACCTGAGCA-3’，下游引物序列：5’-GGAGCGTGCAGTTCAGTGAT-3’；IL-6上游引物序列：5’-TGAGGAGACTTGCCTGGTGA-3’，下游引物序列：5’-TGCAGGAACTGGATCAGGAC-3’；血紅素加氧酶-1（heme oxygenase，HO-1）上游引物序列：5’-CAGTGCCACCAAGTTCAAGC-3’，下游引物序列：5’-CTGGATGTTGAGCAGGAACG-3’；醌氧化還原酶[NAD（P）H：quinone oxidoreductase，NQO-1]上游引物序列：5’-AAGCCGCAGACCTTGTGATA-3’，下游引物序列：5’-TGGCAGCGTAAGTGTAAGCA-3’。GAPDH直接從上海生工生物工程公司購買。

1.2.5 流式細胞術：收集各組細胞制備單細胞懸液[細胞數(shù)量為（5～6）×106]，用PBS清洗2～3次，用0.4mL含1% FBS的PBS重懸細胞，分別加入流式管。各組加入DCFH-DA，37℃孵育20～30min。PBS清洗2～3次，加入0.3mL含1% FBS的PBS重懸細胞，注意避光。用流式細胞儀上機檢測，F(xiàn)lowJo.10軟件分析實驗數(shù)據(jù)。

1.2.6 GSH含量檢測：收集各組細胞[細胞數(shù)量為（5～6）×106]，用PBS作為勻漿介質破碎后離心取上清，檢測細胞內GSH表達水平，測定方法根據(jù)南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作。各組設置3個復孔以減少誤差。

1.2.7 Western blot：BCA法測定蛋白濃度?？贵w濃度分別為：兔抗p38抗體、兔抗p-p38抗體、兔抗Lamin B1抗體、兔抗Nrf2抗體和兔抗p-Nrf2抗體 1:1 000；鼠抗β-tubulin抗體1:4 000，HRP標記的羊抗兔IgG抗體、羊抗鼠IgG抗體1:8 000。用Bio-Rad Image Lab軟件分析條帶光密度，半定量比值測定分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，用Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗，用Levene法行方差齊性檢驗，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗，方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LXA4對LPS誘導BEAS-2B細胞產(chǎn)生IL-6和IL-1β的影響 與對照組比，LPS組BEAS-2B細胞IL-6和IL-1β mRNA水平明顯升高（P＜0.05）。與LPS組比，LXA4+LPS組BEAS-2B細胞IL-6和IL-1β mRNA水平顯著降低（P＜0.05），見圖1。

2.2 LXA4對LPS誘導BEAS-2B細胞氧化應激的影響 炎癥反應的發(fā)生發(fā)展常伴隨著大量氧自由基的產(chǎn)生。在LPS的刺激下，BEAS-2B細胞內ROS水平顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。LXA4預處理后，ROS水平明顯下降，而GSH水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 LXA4對LPS誘導BEAS-2B細胞p38 MAPK通路的影響 p38 MAPK通路在炎癥細胞因子的產(chǎn)生過程中有著重要的作用。與對照組比，LPS可顯著上調p-p38/p38水平（P＜0.01），而LXA4能夠明顯抑制p-p38的蛋白表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3。

2.4 LXA4對LPS誘導BEAS-2B細胞Nrf2通路的影響

在LPS的刺激下，BEAS-2B細胞核內Nrf2表達水平顯著下降（P＜0.01），胞漿Nrf2表達水平上升（P＜0.05），Nrf2磷酸化水平下降（P＜0.05）。而經(jīng)LXA4預處理后，核內Nrf2表達水平顯著升高（P＜0.01），胞漿Nrf2水平明顯下降（P＜0.05），Nrf2磷酸化水平顯著上調（P＜0.01），見圖4。

圖1 各組BEAS-2B細胞IL-6和IL-1β mRNA水平的比較

2.5 LXA4對LPS誘導BEAS-2B細胞Nrf2下游分子表達的影響 與對照組比，LPS組HO-1 mRNA表達水平顯著下降（P＜0.01），NQO-1 mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。LXA4預處理后，HO-1和NQO-1 mRNA水平出現(xiàn)顯著的上調（P＜0.01），見圖5。

3 討論

研究表明支氣管上皮細胞在氣道慢性炎癥以及氣管重塑的過程中發(fā)揮著重要作用。支氣管上皮細胞不僅僅是一層屏障，它可以通過模式識別受體（Toll-like receptor，TLR）識別環(huán)境中的刺激物，分泌上皮細胞來源的細胞因子，橋接固有免疫和適應性免疫[4]?；罨闹夤苌掀ぜ毎纱龠MTh2型細胞因子的釋放，募集并激活其他炎性細胞，發(fā)揮主動調節(jié)作用，同時誘導上皮下纖維的沉積，促進肺部慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，LXA4在哮喘發(fā)病過程中，可以促進NK細胞所介導的粒細胞凋亡，并且可影響NK細胞的細胞毒性作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)LXA4具有抑制支氣管上皮細胞的炎癥反應以及促進炎癥消退的作用。在BEAS-2B細胞中，LXA4預處理顯著抑制了由LPS引起的促炎因子和ROS的產(chǎn)生，同時LXA4還誘導抗氧化酶和GSH的表達顯著上調，并且該作用在一定程度上依賴p38的磷酸化水平和Nrf2的核轉位及磷酸化水平。因此，LXA4在氣道炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，對肺部炎癥的預防和治療具有一定的作用。

圖2 各組BEAS-2B細胞內ROS和GSH水平的比較

圖3 各組BEAS-2B細胞內p-p38和p38表達水平的比較

在過敏性哮喘患者中，由氣道上皮細胞合成與釋放的IL-6可調節(jié)效應性CD4+T細胞的功能，誘導Th1型細胞向Th2型細胞的分化，促進炎癥的發(fā)生發(fā)展，造成肺組織損傷[7-9]。IL-1β是肺部炎性級聯(lián) 反應中的關鍵因子，它可刺激細胞黏附分子的產(chǎn) 生，選擇性募集炎性細胞，誘導多種細胞因子的表達[10]。因此，抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生是控制肺部炎癥發(fā)生發(fā)展的一個重要手段。本研究發(fā)現(xiàn)LXA4預處理可顯著抑制LPS誘導支氣管上皮細胞IL-1β和IL-6 mRNA的表達。這與以往在巨噬細胞、內皮細胞和人視網(wǎng)膜上皮細胞中的研究[11-12]結果一致。

圖4 各組BEAS-2B細胞內Nrf2核轉位以及磷酸化水平的比較

另外，氣道上皮細胞也是直接接觸外部環(huán)境刺激，產(chǎn)生ROS引起氣道氧化應激反應的主要細胞之一[13]。靜息狀態(tài)下，機體內ROS的水平處于動態(tài)平衡，并且維持在極低的水平。過量的ROS也能夠促進炎癥因子以及其他炎癥相關調節(jié)因子的表達，及時清除ROS可有效抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展。LPS可刺激巨噬細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞ROS的生成，本研究發(fā)現(xiàn)，LXA4能夠明顯抑制LPS誘導BEAS-2B細胞內的ROS的產(chǎn)生。另外，GSH是重要的內源性抗氧化劑，可直接清除自由基和ROS，保護過氧化誘導的細胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)LXA4顯著上調了LPS誘導的BEAS-2B細胞胞內GSH的合成與表達。p38 MAPK通路是各種轉錄因子的上游信號調節(jié)器，如NF-κB、AP-1[14]，參與炎癥反應、細胞增殖、細胞分化和細胞死亡等過程。有研究發(fā)現(xiàn)，在中性粒細胞中，LXA4可以降低AP-1與DNA的結合能力，抑制下游炎癥相關基因的轉錄[15]。在氣道上皮細胞中，抑制p38 MAPK通路可抑制IL-6的合成與分 泌[16-18]。NF-κB通路的激活能夠上調IL-1β的分泌，后者又能夠進一步促進NF-κB通路的激活。LPS通過與TLR4結合可快速活化p38 MAPK途徑，本研究發(fā)現(xiàn)氣道上皮細胞在LPS的刺激下，p-p38表達增加，這與氣道炎癥條件下磷酸化的p38表達水平增高具有一致性，而LXA4可以抑制p38 MAPK途徑的激活。因此，LXA4可能通過調控p38 MAPK信號通路抑制促炎因子的表達。該作用與小膠質細胞中的表達一致，而在心肌細胞系H9c2中，LXA4上調了p-p38的表達水平[19-20]，造成這種差異的主要原因可能跟細胞類型有關。

圖5 各組BEAS-2B細胞內HO-1及NQO-1 mRNA水平的比較

研究發(fā)現(xiàn)，通過激活Nrf2通路能夠有效抑制氧化應激反應引起的肺損傷[21]。Nrf2是人體普遍存在的一種抗氧化轉錄因子，在抑制LPS誘導的氧化損傷中發(fā)揮著重要的保護作用[22-23]。在正常狀態(tài)下，Nrf2主要表達于細胞質內，與細胞質中肌動蛋白結合蛋白KEAP1相互結合，保持在一個低表達狀態(tài)，且易被泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當細胞受到氧化劑或毒性物質的刺激時，KEAP1的分子構象發(fā)生改變，Nrf2可從KEAP1上解離后活化，而活化后的Nrf2轉位進入細胞核內并與抗氧化反應原件（antioxidant response element，ARE）的啟動子部位結合，從而促進一系列細胞保護基因和抗氧化酶的表達。Nrf2通路的激活是抗氧化應激反應有效的保護機制。研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者肺泡巨噬細胞內的HO-1表達下降[24]。NQO-1和HO-1具有顯著的抗炎和抗氧化作用，兩者的表達受到Nrf2通路下游ARE的調控[25]。本研究發(fā)現(xiàn)LXA4能夠促進Nrf2的核轉位以及磷酸化，同時ARE下游基因NQO-1和HO-1的表達增高。因此，LXA4的抗氧化作用可能與Nrf2通路激活，使得抗氧化酶NQO-1和HO-1的表達水平升高有關。

綜上所述，LXA4可減輕LPS引起的BEAS-2B細胞炎癥反應并促進炎癥消退，其機制可能一方面與抑制p38 MAPK通路、減少促炎因子的分泌有關；另一方面與增強Nrf2的核轉位以及磷酸化、減輕氧化應激損傷有關。

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