徐春奎 李 艷 陳夢(mèng)靜 呂曉峰

（鹽城市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 鹽城 224002）

近幾年，隨著農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全事件頻發(fā)，令人們神經(jīng)緊繃，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題已成為社會(huì)高度關(guān)注的四大問題之一。β-興奮劑類藥物俗稱“瘦肉精”，常用的包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等十幾種物質(zhì)，目前，此類藥物的主要作用是促進(jìn)動(dòng)物蛋白質(zhì)的合成，加速脂肪的轉(zhuǎn)化和分解，提高瘦肉率；且在食用組織中以肝、腎、肌肉中沉積較高，一旦被人攝入以后，會(huì)產(chǎn)生心跳過快、四肢肌肉顫動(dòng)、頭暈乏力等神經(jīng)中樞中毒癥狀，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，對(duì)人類健康構(gòu)成了極大地威脅，因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部先后多次發(fā)文禁止β-興奮劑類在畜牧生產(chǎn)中使用。

目前國(guó)內(nèi)外已有很多關(guān)于動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測(cè)的分析研究，檢測(cè)獸藥殘留儀器主要是速測(cè)儀、色譜儀、色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。能夠比較準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)儀器主要是色譜儀和色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。在前處理技術(shù)方面，與蔬菜中農(nóng)藥殘留分析相比，由于肌肉組織基質(zhì)比較復(fù)雜，相對(duì)快速簡(jiǎn)單地前處理方法在獸藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用很有限。筆者長(zhǎng)期從事農(nóng)畜產(chǎn)品檢測(cè)工作，本文從2種前處理方法比較來探索液質(zhì)法檢測(cè)β-興奮劑類在豬肝和牛肉基質(zhì)中快速檢測(cè)前處理技術(shù)研究，為探索獸藥殘留檢測(cè)QuEChERS法建立奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器耗材：Agilent 1290 液相色譜儀，Agilent 6460C三重四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）；高速分散器（IKA），離心機(jī)（賽默飛），超聲儀（寧波新芝），旋渦混合器（IKA）；固相萃取裝置（天津恒奧，HHE-12B），氮吹儀（北京同泰聯(lián)，TTL-DCII），天平（艾德姆，HCB602H），瓶口分液器（德國(guó)普蘭德），真空泵（天津恒奧），0.22μm微孔濾膜，固相萃取小柱（500mg/6cc，Waters）。

藥品試劑：7種獸藥為萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、氯丙那林、妥布特羅、特布他林，對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)為萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3、西馬特羅-D7、氯丙那林-D7、妥布特羅-D9、特布他林-D9，均為德國(guó)Dr.公司，標(biāo)準(zhǔn)品純度均不低于99%；乙腈、甲醇、正己烷、異丙醇為色譜純（天地），甲酸、乙酸銨、氨水為優(yōu)級(jí)純，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（Anpel）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別精密稱取適量的7種獸藥萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、氯丙那林、妥布特羅、特布他林標(biāo)品，用甲醇分別溶解配制成濃度為1000μg/mL的各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確吸取100μL的各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋定容至10mL，配制成濃度為10μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液，再準(zhǔn)確吸取100μL的各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋定容至10mL，配制成濃度為0.1μg/mL的混標(biāo)工作液。7種同位素內(nèi)標(biāo)萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3、西馬特羅-D7、氯丙那林-D7、妥布特羅-D9、特布他林-D9的混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液配制同上。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)通過加標(biāo)回收驗(yàn)證檢驗(yàn)檢測(cè)方法，思路為設(shè)3個(gè)濃度梯度，從低到高分別為0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行樣，另設(shè)空白樣品同時(shí)比對(duì)。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制：標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度6個(gè)點(diǎn)分別為0.625μg/kg，1.25μg/kg，2.5μg/kg，5μg/kg，10μg/kg、20g/kg。

1.3 樣品前處理過程

方法1（內(nèi)標(biāo)法）：準(zhǔn)確稱取2.00g（±0.02g）均勻豬肝（或牛肉）試樣，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，再加入6.00mL乙腈-異丙醇混合溶液（4∶1，v/v），渦旋混勻后，振蕩10min，10000r/min離心5min，取全部上清液于55℃下氮吹至近干。加入0.2mol/L乙酸銨緩沖液（pH=5.2）2mL，充分溶解，再加入40μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，55℃條件下避光水浴振蕩2h左右。取出后至室溫，加甲醇4mL，渦旋混勻，肌肉組織8000r/min離心5min，上清液備用；肝臟組織8000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，加3mL正己烷，渦旋后，8000r/min離心5min，取全部下清待凈化備用；固相萃取小柱依次用甲醇、2%甲酸溶液各5mL活化，取全部備用液過柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各5mL淋洗抽干，最后用5%氨水甲醇溶液5mL洗脫；洗脫液于50℃下氮吹干，用0.5mL甲醇-0.1%甲酸溶液（1∶9，v/v）復(fù)溶，渦旋混勻，過0.22μm有機(jī)系微孔濾膜，供上機(jī)待測(cè)。

方法2（內(nèi)標(biāo)法）：準(zhǔn)確稱取2.00g（±0.02g）均勻豬肝（或牛肉）試樣，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)，再加入6.00mL80%乙腈水（含0.3%乙酸），渦旋30s，中速水平振蕩10min，超聲提取5min，8000r/min離心5min，取全部上清液待凈化，以下凈化過程同方法1。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent C18 柱 （Rapid Resolution HD 2.1×10 0mm，1.8-Micron）；流 動(dòng) 相：A相為0.1% （v/v，下同）甲酸水（含5mm的乙酸銨），B相為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序：0～4.0min，從80%A變?yōu)?0%A，4.0～4.5min，從 60%A 變?yōu)?10%A，4.5～6.0min，保 持 10%A；6.0～6.10min從 10%A 變 為 80%A，6.10～10.00min，保持80%A；流速：0.4ml/min；進(jìn)樣量：1.0μL；時(shí)間：10min；柱溫：30 ℃ 。

1.5 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子（ESI+）；毛細(xì)管電壓：40kV；離子源溫度：350℃；干燥氣流速：11L/ min，霧化器壓力：45psi；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）；增加電壓（+）：200V。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 7種β-興奮劑及同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量

表2 豬肝基質(zhì)7種β-興奮劑的加標(biāo)回收情況

表3 牛肉基質(zhì)7種β-興奮劑的加標(biāo)回收情況

2 結(jié)果與分析

2.1 方法1前處理結(jié)果

前處理方法1為江蘇省畜產(chǎn)品例行監(jiān)測(cè)計(jì)劃推薦的方法之一。從表2可以看出，方法1在豬肝中添加7種β-興奮劑類藥物，在低濃度（0.5μg/kg）時(shí)加標(biāo)回收率在84.63%～118.59%，RSD在6.71%～12.75%；在中等濃度水平時(shí)（1μg/kg）加標(biāo)回收率在78.56%～112.17%，RSD在1.70%～10.15%；在高濃度水平時(shí)（2μg/kg）加標(biāo)回收率在76.32%～106.80%，RSD在1.57%～8.26%。從表3可以看出，方法1在牛肉中加標(biāo)回收情況，在低濃度（0.5μg/kg）時(shí)加標(biāo)回收率在100.03%～119.05%，RSD在7.58%～14.15%；在中等濃度水平時(shí)（1μg/kg）加標(biāo)回收率在80.49%～102.77%，RSD在2.18%～8.35%；在高濃度水平時(shí)（2μg/kg）加標(biāo)回收率在81.92%～105.33%，RSD在2.14%～11.53%。

2.2 方法2前處理結(jié)果

前處理方法2為筆者實(shí)驗(yàn)室探索方法。從表2可以看出，方法2在豬肝中添加7種β-興奮劑類藥物，在低濃度（0.5μg/kg）時(shí)加標(biāo)回收率在87.64%～117.00%，RSD在3.48%～12.73%；在中等濃度水平時(shí)（1μg/kg）加標(biāo)回收率在80.23%～96.89%，RSD在1.82%～9.83%；在高濃度水平時(shí)（2μg/kg）加標(biāo)回收率在91.58%～109.25%，RSD在2.37%～12.12%。從表3可以看出，方法2在牛肉中加標(biāo)回收情況，在低濃度（0.5μg/kg）時(shí)加標(biāo)回收率在98.54%～116.63%，RSD在7.88%～12.22%；在中等濃度水平時(shí)（1μg/kg）加標(biāo)回收率在96.07%～108.25%，RSD在0.85%～7.31%；在高濃度水平時(shí)（2μg/kg）加標(biāo)回收率在91.14%～109.52%，RSD在3.15%～11.26%。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

用本試驗(yàn)的2種方法同時(shí)測(cè)定2016年第4季度江蘇省畜產(chǎn)品例行監(jiān)測(cè)任務(wù)中30份豬肝樣品和10份牛肉樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種方法測(cè)定的樣品中7種β-興奮劑均為陰性。同時(shí)各做1份豬肝和牛肉加標(biāo)為陽性樣品，2種前處理方法結(jié)果均在2.00μg/kg左右，均判斷為陽性。

3 討論

QuEChERS法自2003年由Anastassiades等提出以來，廣泛的應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)分析，但是在動(dòng)物源性食品檢測(cè)中應(yīng)用較少。QuEChERS法步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，也比較深得檢測(cè)人員的青睞。根據(jù)江蘇省畜產(chǎn)品例行監(jiān)測(cè)β-興奮劑類判定值為 1μg/kg，筆者從 0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg 3個(gè)濃度梯度設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用在空白豬肝和牛肉樣品中添加藥物計(jì)算回收率來評(píng)價(jià)前處理效果，由表2和表3可以看出，檢測(cè)β-興奮劑類殘留的2種前處理方法的回收率均比較穩(wěn)定，在76.32%～119.05%的范圍內(nèi)，且RSD均在15%之內(nèi)，且7種藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.625%～20μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，均符合檢測(cè)技術(shù)方法要求。但是方法1前處理一個(gè)樣品需要花費(fèi)時(shí)間在4h左右，主要是因?yàn)槊附鈺r(shí)間比較長(zhǎng)，筆者也嘗試過乙腈-異丙醇混合溶液（4∶1，v/v）提取，省略酶解步驟的前處理，但是結(jié)果不是特別理想，尤其是對(duì)萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等苯酚型結(jié)構(gòu)的藥物影響較大，加標(biāo)回收結(jié)果不是很滿意。方法2采用酸化的乙腈水經(jīng)過振蕩超聲充分提取，用固相填料進(jìn)行萃取凈化，快速簡(jiǎn)潔，一般前處理一個(gè)樣品需要花費(fèi)1h左右，與方法1相比，大大節(jié)約了時(shí)間，達(dá)到了省時(shí)省力的效果，最重要的是，2種前處理方法加標(biāo)回收結(jié)果均比較穩(wěn)定，且結(jié)果比較接近，均比較滿意。

4 結(jié)論

本研究以江蘇省例行監(jiān)測(cè)畜產(chǎn)品參數(shù)為依據(jù)，探索定性定量檢測(cè)β-興奮劑類獸藥殘留相對(duì)簡(jiǎn)單省時(shí)省力的前處理方法。與省例行監(jiān)測(cè)β-興奮劑類檢測(cè)建議使用的標(biāo)準(zhǔn)或方法相比，筆者探索了一種相對(duì)簡(jiǎn)單的前處理方法，并具有同等效果的檢測(cè)結(jié)果。為從事畜產(chǎn)品檢測(cè)工作的檢測(cè)人員提供了篩選方法，有助于檢測(cè)機(jī)構(gòu)快速準(zhǔn)確檢測(cè)獸藥定性定量分析，并為日常監(jiān)控提供依據(jù)。

[1]葉妮,孫雷,尹暉,等.UPLC-MS/MS法檢測(cè)動(dòng)物性食品中19種β-受體激動(dòng)劑殘留[J].中國(guó)獸藥雜志,2015,49(9):51-59.

[2]農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008,動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法[S].中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).