馬燕，陳立佼，呂才有，趙明

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201

食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)是保障食品安全和國(guó)民健康的重要手段，也是評(píng)價(jià)某種食品安全性的重要指標(biāo)。我國(guó)已針對(duì)不同食品制定了安全性毒理學(xué)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范，發(fā)展了相應(yīng)的新方法和新技術(shù)，使得我國(guó)食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)整體水平從檢驗(yàn)設(shè)備、人員素質(zhì)，到檢驗(yàn)的技術(shù)水平等均有顯著的提高，并逐漸與國(guó)際接軌，在保障食品安全方面發(fā)揮了重要作用[1]。

我國(guó)現(xiàn)行的食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法標(biāo)準(zhǔn)是由國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)制定并于2015年5月1日起實(shí)施的，一共包括26項(xiàng)[2]，如《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》（GB 15193.1—2014）、《食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范》（GB 15193.2—2014）、《急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》（GB 15193.3—2014）、《細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》（GB 15193.4—2014）、《90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)》（GB 15193.13—2015）。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序，適用于評(píng)價(jià)食品生產(chǎn)、加工、倉(cāng)儲(chǔ)（或貯藏）、運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程所涉及的可能對(duì)健康造成危害的化學(xué)、生物和物理因素的安全性，檢驗(yàn)對(duì)象包括食品及其原料、食品添加劑、新食品原料、輻照食品、食品相關(guān)產(chǎn)品（用于食品的包裝材料、容器、洗滌劑、消毒劑和用于食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的工具、設(shè)備）以及食品污染物[3]。食品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)內(nèi)容包括急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、28 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)、90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)、生殖毒性試驗(yàn)和生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)、毒物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)、致癌試驗(yàn)、慢性毒性與致癌合并試驗(yàn)等[3]。

普洱茶加工的關(guān)鍵工序是一個(gè)多種微生物作用的自然發(fā)酵過(guò)程，微生物的發(fā)酵豐富了產(chǎn)品的內(nèi)含成分與風(fēng)味[4]，也增加了一定的安全風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此對(duì)普洱茶進(jìn)行有效的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)十分必要?；诖耍?003年起，西南大學(xué)的劉勤晉教授已開(kāi)始了普洱茶毒理學(xué)研究[6]。筆者查閱中國(guó)知網(wǎng)、Pubmed，ACS Publications，ScienceDirect-Elsevier，Wiley 和Springer Link等國(guó)內(nèi)外科技文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)9篇中文、6篇英文論文和碩士、博士論文各1篇，以普洱茶或含普洱茶的食品為材料，開(kāi)展了毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究。

1 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)（GB 15193.3—2014）是指1次或24 h內(nèi)多次經(jīng)口給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受試物后，動(dòng)物短期內(nèi)（一般觀察7 d或14 d）出現(xiàn)的毒性效應(yīng)。根據(jù)急性毒性的半數(shù)致死劑量（LD50），即能夠引起動(dòng)物死亡率為50%的受試物劑量，毒物分成5級(jí)（表1）[7]。

表1 急性毒性（LD50）劑量分級(jí)表Table 1 The classification of dose (LD50) in acute oral toxicity tests

劉勤晉等[6]、陳文品等[8-9]、龔加順等[10]、陳娜等[11]、胡雪婷[12]、馬偉光等[13]、Wang等[14]、梁名志等[15]和吳婧等[16]學(xué)者以大、小鼠為模型，研究市售普洱茶、普洱茶特征成分、配方普洱茶、人工接菌發(fā)酵普洱茶、抗氧化制劑（含普洱茶）的急性毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn) LD50大于5 000 mg·kg-1，屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)別。另外，F(xiàn)ujita等[17]研究顯示，一次性攝入 2 000 mg·kg-1體質(zhì)量的普洱茶提取物，小鼠無(wú)異常和死亡（表2）。

2 28 d或90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)

28 d 經(jīng)口毒性試驗(yàn)（GB 15193.22—2014），即通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù) 28 d經(jīng)口接觸受試物后引起的健康損害效應(yīng)，用于評(píng)價(jià)受試物的短期毒性作用[18]。胡雪婷[12]開(kāi)展28 d亞急性毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)普洱生茶高劑量組和熟茶高劑量組肝臟組織切片出現(xiàn)輕微病理學(xué)改變，大鼠的進(jìn)食量、體質(zhì)量、臨床癥狀、血液學(xué)指標(biāo)、器官病理學(xué)觀察、腎臟組織病理學(xué)檢查無(wú)不良反應(yīng)，初步認(rèn)為普洱生茶與熟茶未觀察到有害作用劑量分別為 2 500、5 000 mg·kg-1·d-1。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn) 2 500、5 000 mg·kg-1·d-1的普洱生茶提取物觀測(cè)到了輕微毒性，而 5 000 mg·kg-1·d-1的普洱熟茶提取物未觀察到任何不良反應(yīng)，認(rèn)為攝入 1 250 mg·kg-1·d-1劑量的普洱生茶和 5 000 mg·kg-1·d-1的普洱熟茶提取物是安全的。

表2 普洱茶動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)研究概述Table 2 Summary of the acute animal oral toxicity tests of Pu-erh tea

90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)（GB 15193.13—2015）通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在不超過(guò)其壽命期限10%的時(shí)間內(nèi)（大鼠通常90 d），重復(fù)經(jīng)口接觸受試物后引起的健康損害效應(yīng)，以評(píng)價(jià)受試物的亞慢性毒性[20]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù) 90 d攝入不同劑量（1 250、2 500、5 000 mg·kg-1·d-1）的普洱茶提取物，大鼠無(wú)死亡，體質(zhì)量、攝食率、器官重量無(wú)改變，無(wú)肉眼、臨床和組織病理學(xué)的改變，表明每天5 000 mg·kg-1劑量的普洱熟茶提取物無(wú)明顯不良效應(yīng)。李艷艷等[21]以普洱熟茶（510、1 710 和 5 120 mg·kg-1·d-1）和普洱生茶（550、1 820、5 460 mg·kg-1·d-1）劑量灌胃90 d，各組各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05），除甘油三酯值顯著降低（P<0.05）外，其他各項(xiàng)生化指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)，表明適宜濃度的普洱茶對(duì) SD大鼠血液生理生化指標(biāo)無(wú)不良影響（表3）。

3 遺傳毒性研究

遺傳毒性試驗(yàn)是指對(duì)化學(xué)物質(zhì)改變細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的能力進(jìn)行測(cè)試，確定其致突變性及對(duì)生物的影響，對(duì)可遺傳損傷、致癌性以及其他有關(guān)損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。陳文品等[8,22]、龔加順等[10]和吳婧等[17]開(kāi)展了鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）、小白鼠骨髓微核試驗(yàn)、中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞（CHL）染色體畸變?cè)囼?yàn)、畸形精子檢測(cè)試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和生殖細(xì)胞都沒(méi)有致突變性。Wu等[23]發(fā)現(xiàn)普洱茶提取物不僅無(wú)細(xì)胞和遺傳毒性，還具有抗突變作用（表4）。

表3 普洱茶28 d或90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)研究概述Table 3 Summary of the 28 d or 90 d oral toxicity tests of Pu-erh tea

表4 普洱茶遺傳毒性研究概述Table 4 Summary of the genetic toxicity evaluations of Pu-erh tea

4 其他毒性研究

Wang等[24]應(yīng)用SD大鼠研究普洱茶的生殖毒性和發(fā)育毒性，發(fā)現(xiàn) 2 500 mg·kg-1·d-1的普洱茶提取物能減少F0親本和F1后代的體質(zhì)量增加，改變睪丸、前列腺和卵巢等器官的相對(duì)重量，引起胚胎-胎兒期的胚胎發(fā)育障礙，結(jié)果認(rèn)為普洱茶的生殖毒性和發(fā)育毒性無(wú)效應(yīng)劑量水平是 700 mg·kg-1·d-1。李紅霞等[25]發(fā)現(xiàn)普洱熟茶對(duì)小鼠肝細(xì)胞的毒性極小或無(wú)。王迪[26]研究發(fā)現(xiàn)各劑量的普洱茶提取物，均能夠降低喹烯酮所致的DNA損傷，而本身對(duì)肝細(xì)胞DNA沒(méi)有損傷作用。

5 臨床毒性或不良反應(yīng)研究

Hwang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，健康志愿者（16位男性）每天攝入1 000 mL普洱茶提取物（約20 g原茶），連續(xù)7 d，體質(zhì)量無(wú)變化，無(wú)副作用，血液總膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、LDL-膽固醇、HDL-膽固醇無(wú)顯著變化。Fujita等[17]以志愿者為對(duì)象，開(kāi)展了以下 3項(xiàng)試驗(yàn)研究普洱茶安全性：試驗(yàn)1，健康（n=10）和臨界高膽固醇血癥（n=10）的志愿者，每天攝入（0.75 g或1 g）普洱茶提取物，持續(xù)8周；試驗(yàn)2，健康志愿者（n=10）1次攝入10 g普洱茶提取物研究急性毒性；試驗(yàn)3，健康志愿者（n=11）每天攝入5 g普洱茶提取物，持續(xù)攝入5周；以上試驗(yàn)中志愿者無(wú)腹脹、腹痛、腹瀉、惡心和脹氣等副作用，8個(gè)血液指標(biāo)（白血球、紅血球、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞平均容量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、血小板）和14個(gè)生化指標(biāo)（谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、三磷酸鳥(niǎo)苷、總蛋白、淀粉酶、血糖、總膽固醇、LDL膽固醇、甘油三酯、尿素、血尿素氮、肌酸酐、C型反應(yīng)性蛋白）無(wú)顯著變化。

另外 Kubota等[28]以超重的日本志愿者（n=36）研究普洱茶減肥活性，發(fā)現(xiàn)每天攝入1 g普洱茶提取物，持續(xù)12周，無(wú)腹脹、腹痛、腹瀉、過(guò)敏等不良反應(yīng)，測(cè)定的血液、生化指標(biāo)無(wú)異常。Chu等[29]發(fā)現(xiàn)代謝綜合征病人（n=45），每天攝入約5 g普洱茶，3個(gè)月，除一人腹瀉外，未見(jiàn)其他不良反應(yīng)，血液、尿液檢查未見(jiàn)異常。Yang等[30]以代謝綜合征患者（n=36），每天攝入1 g普洱茶提取物，持續(xù)3個(gè)月，試驗(yàn)中未觀察到腹痛、腹瀉或過(guò)敏癥等不良反應(yīng)。

在以上研究中，F(xiàn)ujita等[17]、Kubota等[28]和Yang等[30]制備普洱茶提取物的方法相同，流程為100 g茶葉加入900 mL水，100℃提取60 min，2 050×g離心 30 min，濾紙過(guò)濾，濃縮，熱風(fēng)干燥制得粉末。他們的研究均未明確得率，筆者根據(jù)普洱茶速溶粉和茶膏的加工經(jīng)驗(yàn)推算，其得率可能為20%左右，也即1 g提取物相當(dāng)于約5 g原茶。因此Fujita等[17]的研究中，每天攝入 5 g普洱茶提取物，推測(cè)相當(dāng)于25 g普洱茶。根據(jù) Fujita等[17]的研究（推測(cè)每天約25 g普洱茶，持續(xù)5周）以及Hwang等[27]的報(bào)道（每天攝入約20 g原茶的提取物，7 d），筆者認(rèn)為成人一次性攝入 20 g左右普洱茶是安全的。但是由于大劑量的多酚、咖啡堿等化學(xué)物質(zhì)對(duì)身體存在副作用，建議適量飲用。

6 結(jié)論

從已有細(xì)胞、動(dòng)物和人體安全性毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，除孕婦、兒童外，普洱茶具有較高的飲用安全性。但是，茶業(yè)科研、加工人員應(yīng)當(dāng)科學(xué)認(rèn)識(shí)和重視普洱茶的真菌毒素風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)接種安全菌種、實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程等措施改良工藝，控制普洱茶的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

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