劉穎　孫學(xué)佳　肖銦　劉適　趙晶　秦偉

[摘要] 目的 研究康萊特注射液分別在PTEN正常表達(dá)和低表達(dá)時(shí)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而評(píng)估康萊特注射液對(duì)胰腺癌的治療作用。方法 該研究于2016年2月—2017年9月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院進(jìn)行，人胰腺癌PANC-1細(xì)胞、沉默PTEN表達(dá)的胰腺癌PANC-1細(xì)胞分別分成康萊特處理組及未處理組，以流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)胰腺癌細(xì)胞凋亡改變。結(jié)果 康萊特處理組胰腺癌細(xì)胞凋亡率（59.67±13.23）%明顯高于對(duì)照組（13.26±4.72）%（P<0.01），shPTEN+康萊特組和shPTEN組細(xì)胞凋亡率（39.85±13.47）%和（27.37±8.62）%也高于對(duì)照組（13.26±4.72）（P<0.05）。 結(jié)論 康萊特注射液以調(diào)控PTEN 表達(dá)的方式誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞凋亡，康萊特注射液是一種治療胰腺癌的潛力藥物。

[關(guān)鍵詞] 胰腺癌；康萊特；PTEN

[中圖分類號(hào)] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2018）02（c）-0023-03

PTEN - based Kanglaite Induces Apoptosis in Human Pancreatic Cancer Cells

LIU Yin1， SUN Xue-jia2， XIAO Yin1， LIU Shi3， ZHAO Jing3， QIN Wei4

1.Oncology Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 2. Radiology Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 3. General Surgery Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 4. Academic Affairs Office， Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China

[Abstract] Objective This paper tries to study the effect of Kanglaite Injection on the apoptosis of human pancreatic cancer cells in normal and low expression of PTEN， and to evaluate the therapeutic effect of Kanglaite injection on pancreatic cancer. Methods This study was carried out in Harbin Medical University School of Public Health from February 2016 to September 2017 Pancreatic cancer PANC-1 cells and PTEN-expressing pancreatic cancer PANC-1 cells were divided into Kanglaite treatment group and untreated group respectively. The apoptosis of pancreatic cancer cells was examined by flow cytometry. Results The apoptosis rate of pancreatic cancer cells in KLT group（59.67±13.23）% was significantly higher than that in control group （13.26±4.72）%（P<0.01）. The apoptotic rates of shPTEN + KLT group and shPTEN group （39.85±13.47）% and （27.37±8.62）% was also higher than the control group（13.26±4.72）%（P<0.05）. Conclusion Kanglaite injection induces apoptosis of human pancreatic cancer cells by regulating PTEN expression. Kanglaite injection is a potential drug for pancreatic cancer.

[Key words] Pancreatic cancer； Kanglaite； PTEN

胰腺癌是惡性程度最高的癌癥之一，患者的5年生存率小于5%[1]，它的發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，而現(xiàn)有的治療措施效果差強(qiáng)人意，故而越來(lái)越多的新藥物抗胰腺癌的相關(guān)研究在全球范圍開展起來(lái)?？等R特注射液的主要成分是中藥薏苡仁油[2]， 它在中國(guó)主要用于非小細(xì)胞肺癌、肝癌以及胃癌的輔助治療[3-5]，它能以多種機(jī)制作用于多種信號(hào)通路或靶點(diǎn)發(fā)揮抗癌作用[2-4，6-11]，但是它抗胰腺癌的作用及機(jī)制卻鮮有研究。PTEN是PI3K/Akt/mTOR通路的一個(gè)重要調(diào)控因子，也是一個(gè)非常重要的抑癌基因。該研究起始于2016年2月—2017年9月，該研究實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，該研究通過(guò)觀察經(jīng)康萊特注射液分別在PTEN正常表達(dá)或低表達(dá)時(shí)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響，初步闡釋了康萊特注射液抗胰腺癌的機(jī)制，并將為康萊特注射液治療胰腺癌的早日臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 PTEN基因沉默

人胰腺癌PANC-1細(xì)胞購(gòu)于中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，以慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法沉默PANC-1細(xì)胞PTEN的表達(dá)。首先將含熒光素酶和PTEN的shRNA分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入人胰腺癌PANC-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)24 h后更換培養(yǎng)基，隨后在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的第36、48、60、72 h獲取上清液，并將獲得的上清液過(guò)濾、離心及重懸浮，最后把含有shLuc或shPTEN的慢病毒顆粒以適當(dāng)濃度轉(zhuǎn)導(dǎo)入人胰腺癌PANC-1細(xì)胞。用Western blot法檢驗(yàn)PTEN基因沉默的效果。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)PTEN正常表達(dá)和低表達(dá)的PANC-1細(xì)胞，首先用10 μL/mL的康萊特注射液或去離子水處理細(xì)胞48 h，以流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)胰腺癌細(xì)胞凋亡改變。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

把收獲、洗滌后的PTEN正常表達(dá)和低表達(dá)的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞分別加入10 μL異硫氰酸熒光素和10 μL碘化丙啶，隨后在暗室中室溫下培育10 min，然后用FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析染色后的細(xì)胞，其中右下象限標(biāo)示為早期凋亡細(xì)胞，右上象限標(biāo)示為晚期凋亡細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，t檢驗(yàn)，3組及以上數(shù)值間差異采用單因素方差分析檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果表明，將PTEN正常表達(dá)和低表達(dá)PANC-1細(xì)胞用10 μL/mL的康萊特注射液或去離子水分別處理48 h后，康萊特處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組 （P<0.01）， shPTEN+康萊特組和shPTEN組細(xì)胞凋亡率也高于對(duì)照組 （P<0.05），詳見圖1。該研究結(jié)果證實(shí)康萊特處理組胰腺癌細(xì)胞凋亡率（59.67±13.23）%明顯高于對(duì)照組（13.26±4.72）%（P<0.01），并且康萊特組細(xì)胞PTEN表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.01），shPTEN組、shPTEN+康萊特組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（P<0.05）。

3 討論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在康萊特注射液誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中PTEN起到了關(guān)鍵性作用，而敲低PTEN基因的表達(dá)水平能夠減弱康萊特注射液誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用。鮑英等人[12]的研究表明經(jīng)20 μl/mL康萊特作用胰腺癌8988細(xì)胞72 h 后， 經(jīng)TUN EL染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例為11.84%，而對(duì)照組為3.24 %，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該研究的差異可能由于實(shí)驗(yàn)方法、細(xì)胞株及沒(méi)進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)所致的實(shí)驗(yàn)誤差引起的。

PTEN基因是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵的抑制因子之一，它的缺失或者失活都能夠引起PI3K/Akt/mTOR通路的活化。PI3K/Akt/mTOR通路的激活能加速腫瘤組織血管生成，促使腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，與此同時(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡 [13]。PTEN是PI3K/Akt/mTOR通路的一個(gè)重要調(diào)控因子，也是一個(gè)非常重要的抑癌基因。提高PTEN 基因的表達(dá)水平是康萊特注射液對(duì)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的抑制作用機(jī)制之一， PTEN基因表達(dá)水平的降低可以在一定范圍內(nèi)減弱康萊特注射液對(duì)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的抑制作用?？等R特注射液誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞增殖凋亡作用的發(fā)揮在一定程度上是通過(guò)借助PTEN調(diào)控此通路實(shí)現(xiàn)的。

該研究在國(guó)際上首次研究了康萊特注射液誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用與PTEN基因的關(guān)系，初步揭示了康萊特注射液抗胰腺癌作用的機(jī)制，將為康萊特注射液治療胰腺癌的早日臨床應(yīng)用提供理論支持。

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（收稿日期：2017-11-28）