高藝羨, 陳萍虹, 聶丹丹

(通標標準技術(shù)服務(wù)有限公司廈門分公司, 福建 廈門 361000)

茶葉是世界三大飲料之一,廣受大眾歡迎,其安全性越來越受到關(guān)注。為了防治病蟲害,茶葉種植過程中廣泛使用農(nóng)藥,農(nóng)藥殘留分析是茶葉質(zhì)量安全的一個重要指標。我國國家標準GB 2763-2016規(guī)定了茶葉中48種農(nóng)藥的最大殘留量(MRL)[1],國際上對茶葉的農(nóng)藥殘留量要求也日趨嚴格[2]。

目前,國內(nèi)外涉及茶葉中農(nóng)藥殘留傳統(tǒng)的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[3-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7-11]和氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[12-18]。其中GC-MS/MS具有極高的選擇性、極強的抗干擾能力、高靈敏度和高通量離子傳輸效率及準確定量的特點,已經(jīng)被廣泛應用于茶葉的農(nóng)藥殘留測試中。

茶葉中富含多種有機酸、維生素、天然色素、咖啡堿、蛋白質(zhì)、游離糖以及鋅、硒、錳、氟等微量元素,基質(zhì)成分復雜[19]。在色譜分離中,最明顯的基質(zhì)效應是基質(zhì)組分與分析物的共洗脫,從而影響分析物檢測,此類效應能通過改善檢測器的選擇性、色譜分離和/或樣品前處理解決[20]。GC-MS/MS還存在一些比較難以解決的基質(zhì)效應,主要是Erney等[21]提出的基質(zhì)誘導響應增強效應,此效應主要影響兩類化合物,一類是在汽化溫度下熱不穩(wěn)定的化合物,一類是樣品進入色譜柱或檢測器時易被吸附的化合物。另外還有一種基質(zhì)誘導響應減弱效應,此效應由GC系統(tǒng)中低揮發(fā)性或非揮發(fā)性基質(zhì)組分的逐漸積聚造成,這些將導致新活性位點的形成以及分析物響應值的逐漸減小[22-24]。

基質(zhì)誘導增強效應可以通過去除活性位點或基質(zhì)組分減弱,或利用替代的校準方法進行補償,方式包括基質(zhì)匹配標準溶液、添加保護劑、標準加入法以及同位素標記內(nèi)標[20]。目前大多數(shù)方法采用基質(zhì)樣品配制農(nóng)藥標準溶液以校正基質(zhì)效應引入的定量誤差,但對于不同種類的茶葉,須采用相同的茶類樣品配制農(nóng)藥標準工作溶液,由于茶葉農(nóng)藥殘留檢出陽性率較高,空白茶葉樣品少,較難配制相應的基質(zhì)匹配標準溶液,且操作過程繁瑣。

本研究針對茶葉這種復雜基質(zhì),建立了一種向樣品中加入QuEChERS緩沖鹽,用乙腈提取和固相萃取法(SPE)凈化、GC-MS/MS測定53種農(nóng)藥殘留量的方法,通過在儀器端采用超高惰性流路和利用雙色譜柱串聯(lián)設(shè)置柱后反吹模式、在標準溶液中添加混合保護劑、并結(jié)合雙內(nèi)標進行定量的方式,有效地降低農(nóng)藥的基質(zhì)效應,實現(xiàn)茶葉中多種農(nóng)藥快速有效的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B-7000D型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電子轟擊(EI)離子源(美國Agilent公司); AB204-S分析天平(瑞士Mettler Toledo公司); Centrisart?D-16C高速冷凍離心機(德國Sartorius公司); XW-80A渦旋混合器(上海精科公司); SPH-310F搖床(上海世平公司); OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)。

QuEChERS緩沖鹽包(美國Waters公司); ENVI-Carbon/NH2凈化小柱(美國Agilent公司);乙腈、丙酮、甲苯(色譜級,美國Merck公司); 53種農(nóng)藥標準品和2種內(nèi)標(純度≥ 98%,德國Dr. Ehrenstorfer公司);古洛糖酸內(nèi)酯、山梨醇(純度≥ 98%,德國Sigma-Aldrich公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1標準溶液的配制

分別準確稱取適量的農(nóng)藥標準品,用丙酮溶解并定容,配制成1 000 mg/L的53種單一農(nóng)藥標準儲備液和兩種內(nèi)標儲備液(蒽醌-D8和磷酸三苯酯);移取適量農(nóng)藥標準儲備溶液至容量瓶中,用丙酮稀釋并定容,配制成10 mg/L的農(nóng)藥混合標準儲備液;移取適量內(nèi)標儲備溶液至容量瓶中,用丙酮稀釋并定容,配制成10 mg/L的內(nèi)標混合儲備液;稱取適量古洛糖酸內(nèi)酯和山梨醇,用乙腈溶解并定容,配制成10 g/L的保護劑混合儲備液;再移取上述的農(nóng)藥混合標準儲備液、內(nèi)標混合儲備液和保護劑混合儲備液至容量瓶中,用丙酮稀釋并定容,配制成濃度分別為20、50、100、200、300、500 μg/L的標準工作溶液,其中內(nèi)標濃度為200 μg/L,保護劑濃度為200 mg/L。農(nóng)藥標準溶液均貯存于(-18±4) ℃冰箱中。

1.2.2樣品前處理

茶葉樣品粉碎,混勻,取2.5 g樣品于50 mL離心管中,加入25 μL內(nèi)標溶液(10 mg/L),再加入10 mL水,渦旋使樣品分散到水溶液中,浸泡30 min。加入25 mL乙腈,放到搖床上振蕩5 min后加入QuEChERS緩沖鹽包,混勻后置于冷凍離心機中,在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min。

用移液槍取20 mL上清液于另一50 mL離心管中,加入6.67 mL甲苯,渦旋混勻后上凈化小柱。凈化小柱先用10 mL乙腈-甲苯溶液(3∶1, v/v)活化,上樣后讓其自然吸附,再用5 mL乙腈-甲苯溶液(3∶1, v/v)進行洗脫。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至剩余少許有機溶劑后,用氮吹儀吹干,用1 mL丙酮定容。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件 兩根HP-5MS UI色譜柱(15 m×0.25 mm×0.25 μm)串聯(lián),載氣為高純氦氣(純度99.999%),流速為0.9 mL/min(1#柱)和1.1 mL/min(2#柱)。柱溫起始溫度60 ℃,保持1 min,以40 ℃/min速率升溫至170 ℃,再以10 ℃/min速率升溫至310 ℃。進樣方式為脈沖不分流,脈沖壓力137.9 kPa, 0.75 min后打開分流閥,進樣量2 μL,進樣口溫度280 ℃,傳輸線溫度280 ℃。采用柱后反吹,在運行結(jié)束后,設(shè)置柱溫310 ℃,反吹壓力為275.8 kPa,進樣口壓力為6.895 kPa,反吹時間為5 min。在GC-MS/MS上設(shè)置的雙色譜柱及后運行反吹模式見圖1。

圖 1 雙色譜柱串聯(lián)及后運行反吹示意圖Fig. 1 Illustration of tandem double capillary columns with post-run backflushing

質(zhì)譜條件 電離方式為電子轟擊電離源(EI),動態(tài)多反應離子監(jiān)測(dMRM)模式監(jiān)測,電離能量70 eV。四極桿溫度150 ℃,離子源溫度280 ℃,溶劑延遲3 min。碰撞氣為高純氮氣(純度99.999%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS/MS條件優(yōu)化

本文通過優(yōu)化柱箱升溫程序,可以在20.75 min內(nèi)將53種農(nóng)藥有效分離。茶葉基質(zhì)復雜,進樣方式采用脈沖不分流,可以降低基質(zhì)在襯管內(nèi)的停留時間,從而降低基質(zhì)效應帶來的影響。通過采用雙色譜柱串聯(lián),設(shè)置柱后反吹模式,在分析待測物質(zhì)后,利用壓力差將停留在色譜柱內(nèi)部的低揮發(fā)性基質(zhì)組分往進樣口方向吹掃,可以提高色譜柱的壽命,降低維護成本。

質(zhì)譜端采用dMRM模式,優(yōu)化離子對的碰撞能量,針對不同農(nóng)藥的出峰時間特點選擇合適的峰寬,在確保每個離子對掃描10個點以上使每個離子對的駐留時間達到最優(yōu)化,并根據(jù)茶葉的特點,刪去在基質(zhì)中干擾嚴重的離子對,最終得到53種農(nóng)藥及兩種內(nèi)標的保留時間、離子對、碰撞電壓等dMRM參數(shù),詳見表1。根據(jù)優(yōu)化后的GC-MS/MS條件對農(nóng)藥混合標準溶液進行分析,該條件下53種農(nóng)藥可獲得較好的分離,其峰形和信噪比均較理想。53種農(nóng)藥(20 μg/L)的總離子流色譜圖(TIC)見圖2。

表 1 53種農(nóng)藥及內(nèi)標的保留時間及GC-MS/MS質(zhì)譜分析參數(shù)

表 1 (續(xù))

* Internal standard.

圖 2 53種農(nóng)藥標準溶液(20 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of the 53 pesticide standards at 20 μg/LPeak Nos. are the same as that in Table 1.

2.2 GC-MS/MS惰性流路的選擇

基質(zhì)效應包括基質(zhì)誘導增強效應和基質(zhì)誘導減弱效應,與GC系統(tǒng)中活性位點的數(shù)量、分析物的特點、基質(zhì)類型、相互作用時間、進樣口參數(shù)等有關(guān)[20]。農(nóng)藥化合物通常含有羥基(-OH)和氨基(R-NH-)官能團、咪唑類和苯并咪唑類化合物(-N=)、氨基甲酸酯(-O-CO-NH-)、尿素衍生物(-NH-CO-NH-)和有機磷(-P=O)基團。這類分子易與流路表面的活性位點發(fā)生相互作用,發(fā)生化合物吸附或降解。因此,應盡量保持GC系統(tǒng)的惰性去活。GC系統(tǒng)樣品流路中的各個部件若是惰性化程度不夠,將可能導致物質(zhì)響應低甚至不出峰、峰拖尾、不穩(wěn)定等情況。GC系統(tǒng)樣品流路從進樣到檢測器,涉及進樣口及其襯管和分流平板、色譜柱、兩通分流接口、密封圈。提高整個流路的惰性化程度可以有效地降低基質(zhì)效應的影響。

在同一條件下,由53種農(nóng)藥配制成茶葉基質(zhì)混合標準溶液(10 μg/kg),分別采用普通襯管和超高惰性襯管連續(xù)進樣10針,結(jié)果表明超高惰性襯管具有更優(yōu)的穩(wěn)定性。對于基質(zhì)效應明顯的農(nóng)藥,均有類似的現(xiàn)象。因此,本方法GC-MS/MS采用具有超高惰性的分流/不分流進樣口、襯管、分流平板及色譜柱。

2.3 保護劑的選擇

有研究表明[22-24],含多個羥基的糖類和糖類衍生物(如山梨醇)可增強峰信號,適用于低揮發(fā)性農(nóng)藥,而古洛糖酸內(nèi)酯可形成寬峰,覆蓋了非常廣泛的農(nóng)藥洗脫范圍,適用于半揮發(fā)性農(nóng)藥,同時使用古洛糖酸內(nèi)酯和山梨醇可實現(xiàn)最大的整體增強效果,故本研究采用兩者的混合溶液作為保護劑。

本文以4種不同的農(nóng)藥(氟樂靈、五氯苯胺、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯)為例,考察了基質(zhì)組分和保護劑對農(nóng)藥在GC系統(tǒng)中的影響。由圖3a可以看出,純?nèi)軇┲?未添加基質(zhì)組分和保護劑)農(nóng)藥的色譜圖峰形較寬。這是由于GC系統(tǒng)中游離硅醇基和非揮發(fā)性基質(zhì)的沉積,在GC進樣口和色譜柱中產(chǎn)生大量活性位點,而敏感分析物在這些活性位點上易發(fā)生吸附或降解。當向農(nóng)藥標準溶液中添加混合保護劑(圖3b)或基質(zhì)組分(圖3c)后,保護劑或基質(zhì)組分會限制活性位點,從而有效改善了農(nóng)藥在純?nèi)軇┲蟹逋衔驳那闆r。由兩種情況的譜圖可以看出,保護劑與基質(zhì)具有相似的效果,這說明保護劑可以替代基質(zhì),解決農(nóng)藥殘留測試中難以配制茶葉基質(zhì)匹配標準溶液的問題,提高配制農(nóng)藥標準溶液的效率。

圖 3 不同溶液中4種農(nóng)藥(10 μg/kg)的GC-MS/MS色譜圖Fig. 3 GC-MS/MS chromatograms of four pesticides (10 μg/kg) in various solutions a. solvent standard without the addition of protectants; b. standard with the addition of protectants; c. matrix-matched standard.

同時,本文還比較了農(nóng)藥在純?nèi)軇藴嗜芤褐泻驮谔砑恿吮Ｗo劑的標準溶液中兩種不同的基質(zhì)效應,結(jié)果見圖4。基質(zhì)效應(matrix effect, ME)=B/A×100%,其中,A為純?nèi)軇┗蛱砑恿吮Ｗo劑的標準溶液中農(nóng)藥的響應值,B為空白樣品基質(zhì)中添加相同含量農(nóng)藥的響應值[17]?；|(zhì)效應越接近于100%,說明基質(zhì)效應越不明顯,標準溶液定量的結(jié)果越準確。

從純?nèi)軇┑幕|(zhì)效應數(shù)據(jù)(圖4陰影柱)可以看出,在GC-MS/MS上,茶葉中農(nóng)藥的基質(zhì)增強效應明顯,近一半的農(nóng)藥落在了基質(zhì)增強部分(130%～200%和>200%)。而添加保護劑后(圖4空白柱),大部分農(nóng)藥的基質(zhì)效應明顯減弱,并且基質(zhì)效應在60%～130%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)量比例增多。這說明在農(nóng)藥標準溶液中添加保護劑可有效提高定量的準確性。

因此,本文采用添加了保護劑的標準溶液進行定量,能夠很好地解決純?nèi)軇藴嗜芤旱姆逍螌?、保留時間漂移及基質(zhì)效應的問題。同時,保護劑的使用可以惰性化GC系統(tǒng),減少分析物的相互作用,從而提高其耐用性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,降低GC系統(tǒng)中進樣口和色譜柱的維護頻率。

2.4 內(nèi)標的選擇

一方面,在優(yōu)化了儀器端參數(shù)條件、選用惰性流路,并在標準溶液中添加保護劑之后,茶葉中基質(zhì)效應<60%的農(nóng)藥比例仍有35.8%(圖4空白柱),給定量帶來一定的誤差;另一方面,在茶葉基質(zhì)干擾下,農(nóng)藥在前處理過程中易被吸附或降解,故采用內(nèi)標法定量可以提高定量結(jié)果的準確性。由于TPP的化學基團與大部分農(nóng)藥存在類似的結(jié)構(gòu)特點,適合作為農(nóng)藥殘留測試的內(nèi)標,已被用于多個QuEChERS標準方法[25-27],故本方法首先采用TPP作內(nèi)標考察定量效果。

但研究中發(fā)現(xiàn),七氯、八氯二丙醚、殺螟硫磷、毒死蜱、蒽醌、三唑酮、三氯殺螨醇、甲基異柳磷、環(huán)氧七氯、喹硫磷等10種農(nóng)藥,若采用TPP作內(nèi)標無法達到理想的回收效果。由于這些物質(zhì)的保留時間均在蒽醌附近,且蒽醌是一種在茶葉中常檢出的物質(zhì),歐盟的MRL低,只有0.02 mg/kg[2],故本研究以蒽醌為代表進行考察。根據(jù)文獻報道,蒽醌的氘代物(An-D8)可以提高蒽醌定量的準確性[14,28]。故本研究采用An-D8作為另一種內(nèi)標,并針對以上10種農(nóng)藥,對兩種內(nèi)標的選擇進行了比較。

圖 4 茶葉樣品中53種農(nóng)藥(10 μg/kg)在GC-MS/MS 分析中的基質(zhì)效應Fig. 4 Matrix effects of the 53 pesticides (10 μg/kg) in tea during GC-MS/MS analysis

在低(0.01 mg/kg)、中(0.10 mg/kg)、高(0.25 mg/kg)3個加標濃度水平下,重復測定兩次,分別采用An-D8和TPP作內(nèi)標進行定量,分析茶葉中這10種農(nóng)藥的加標回收率,結(jié)果見表2。通過比較可知,若采用TPP作內(nèi)標得到的回收率均偏低,無法滿足測試要求,而采用An-D8作內(nèi)標則能將回收率校正至合理范圍。因此,本方法選擇An-D8作為這10種農(nóng)藥的內(nèi)標。

2.5 標準曲線與定量限

按1.2.1節(jié)配制農(nóng)藥標準工作溶液,在優(yōu)化后的儀器實驗條件下測定各溶液,繪制標準曲線,得到線性方程及相關(guān)系數(shù)(r2)。結(jié)果顯示本方法中的53種農(nóng)藥在20～500 μg/L內(nèi)均具有良好的線性(r2≥0.99),其中氯氰菊酯為兩種同分異構(gòu)體之和,其線性范圍為40～1 000 μg/L。以S/N=3確定檢出限(LOD),以S/N=10確定定量限(LOQ),得到本方法中28種農(nóng)藥的LOQ小于10 μg/kg,另外25種農(nóng)藥的LOQ在10～20 μg/kg之間(見表3)。

表 2 采用不同內(nèi)標分析茶葉中10種農(nóng)藥的加標回收率

表 3 (續(xù))

y: peak area of the quantitative ion;x: mass concentration, μg/L.

2.6 加標回收率與精密度

選擇無農(nóng)藥殘留的有機茶作為空白樣品基質(zhì),向樣品中添加53種農(nóng)藥進行樣品加標回收試驗。在低(0.01 mg/kg)、中(0.10 mg/kg)、高(0.25 mg/kg)3個加標水平下,每個水平做6個平行樣品,按照本方法進行測定,結(jié)果見表4。由表4可知,在茶葉基質(zhì)中,除了喹硫磷由于靈敏度差,未能進行低水平回收率測試和精密度測試外,農(nóng)藥的回收率為72.5%～130.9%,相對標準偏差(RSD)為0.4%～19.4%,其中93.7%的目標物的RSD小于15%。數(shù)據(jù)說明本方法精密度高,重復性好。

2.7 實際樣品的測定

利用所建立的方法對烏龍茶、綠茶、紅茶、普洱茶、白茶等不同茶葉樣品共122份進行了53種農(nóng)藥殘留的檢測。結(jié)果顯示,針對本檢測方法中的53種農(nóng)藥,檢出率較高的農(nóng)藥為聯(lián)苯菊酯、蒽醌、氯氰菊酯和溴蟲腈,檢出率分別為60.7%、48.4%、37.7%和29.5%,圖5是代表性樣品(烏龍茶和綠茶)的總離子流色譜圖。研究結(jié)果表明,本方法適用于茶葉中53種農(nóng)藥殘留的檢測。

表 4 53種農(nóng)藥在茶葉中的加標回收率及相對標準偏差(RSD) (n=6)

圖 5 代表性樣品的總離子流色譜圖Fig. 5 Total ion current chromatograms of typical positive samples

3 結(jié)論

本文利用固相萃取-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),建立了茶葉中53種農(nóng)藥殘留的雙內(nèi)標分析方法,測定的農(nóng)藥種類較全,涵蓋了有機磷類、有機氯類、擬除蟲菊酯類等農(nóng)藥;并且通過優(yōu)化儀器色譜、質(zhì)譜參數(shù),采用動態(tài)多反應監(jiān)測模式和加入保護劑等方式減弱了茶葉的基質(zhì)效應,降低了背景干擾,提高了分析靈敏度,可滿足國內(nèi)外對茶葉中多種農(nóng)藥殘留量的日常檢測要求。

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