王連珠, 方恩華, 王彩娟, 陳 泳, 林子旭, 徐敦明

(1. 漳州出入境檢驗(yàn)檢疫局, 福建 漳州 363100; 2. 廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局, 福建 廈門(mén) 361012)

五氯酚及其鈉鹽屬高毒有機(jī)氯農(nóng)藥,具有致畸、致癌、致突變等毒副作用,曾作為除草劑、殺菌劑、防腐劑、生物殺滅劑等在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。五氯酚化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,殘留期長(zhǎng),可通過(guò)生物富集進(jìn)入食物鏈;五氯酚鈉具有較高的水溶性,易通過(guò)水載體廣泛擴(kuò)散,從而影響生態(tài)安全并產(chǎn)生生物蓄積。農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)[1]規(guī)定所有食品動(dòng)物禁用五氯酚鈉,在動(dòng)物源食品中不得檢出。為進(jìn)一步規(guī)范食品安全監(jiān)督抽檢工作,《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則(2018年版)》明確規(guī)定了畜禽肉及其副產(chǎn)品檢測(cè)五氯酚鈉項(xiàng)目[2]。

目前五氯酚及其鈉鹽的分析方法有氣相色譜法(GC)[3,4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-7]、液相色譜法(LC)[8,9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10,11]和超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(UPLC-HRMS)[12]。GC和GC-MS需柱前衍生,操作繁瑣;LC靈敏度不高,且定性能力差;LC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單的特點(diǎn),目前廣泛應(yīng)用于五氯酚的測(cè)定[10,11]。

食品中五氯酚的前處理方法有液液萃取法(LLE)[3-5,7]和固相萃取法(SPE)[11,12],但以上方法試劑使用量大,操作繁瑣。QuEChERS前處理方法于2003年由Anastassiades等[13]首次提出,如今已成為果蔬中農(nóng)藥多殘留分析的首選方法及分散固相萃取(d-SPE)的“模板”方法[14], QuEChERS可根據(jù)分析物的理化性質(zhì)及基質(zhì)種類(lèi)選擇不同的分散吸附劑。目前采用QuEChERS分析動(dòng)物源食品中藥物殘留的檢測(cè)方法也有許多報(bào)道[15-17],但未有采用QuEChERS分析動(dòng)物源食品中五氯酚的報(bào)道。

本文采用改良的QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS分析技術(shù),建立了動(dòng)物源食品中痕量五氯酚及其鈉鹽的快速測(cè)定方法。該法效率高,操作簡(jiǎn)單,滿足殘留分析及法規(guī)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC-30A超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); API 5500Q三重四極桿/復(fù)合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司); GM 200碾磨儀(德國(guó)Retsch公司); T25高速分散機(jī)(德國(guó)IKA公司); KQ-500 DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); 3-30K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)大儀器廠); Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)。

五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.997 mg/mL,溶于甲醇)購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。碳十八鍵合鋯膠(Z-Sep+)分散吸附劑(美國(guó)Supelco公司); C18吸附劑(40 μm,美國(guó)Agilent公司);無(wú)水硫酸鎂(MgSO4)、乙酸銨均為分析純(上海國(guó)藥集團(tuán));甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)Merck公司);甲酸、乙酸均為色譜純(美國(guó)Fluka公司)。實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)Milli-Q超純水器純化的超純水。豬肉、豬肝、雞肉、魚(yú)肉、牛奶、雞蛋樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取適量五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈稀釋并配制標(biāo)準(zhǔn)工作液;用乙腈-水(1∶1, v/v)配制0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

移取0.5 mL空白樣品提取液6份,分別置于2 mL離心管中,加入20 μg/L五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液0、25、50、100、150、250 μL,再加入500、475、450、400、350、250 μL水,混勻過(guò)濾,配制0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/L基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

稱取2.00 g均質(zhì)樣品,置于50 mL具塞離心管中,加入1%(v/v)乙酸乙腈溶液10 mL,高速均質(zhì)(或渦旋)1 min,加入400 mg無(wú)水硫酸鎂,超聲提取20 min,以9 500 r/min離心5 min,取上清液,殘?jiān)尤?%(v/v)乙酸乙腈溶液10 mL,重復(fù)提取1次,合并提取液,旋蒸濃縮至近干,加入2.0 mL乙腈溶解,轉(zhuǎn)移至裝有200 mg MgSO4、400 mg C18的離心管中,渦旋30 s,以9 500 r/min離心5 min,移取0.5 mL凈化液,置于2 mL離心管中,加入0.5 mL水,混勻過(guò)濾,供UPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A相為含5 mmol/L乙酸銨的0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1 min, 25%B, 1～4 min, 25%B～95%B; 4～6 min, 95%B; 6～7 min, 95%B～25%B; 7～9 min, 25%B。進(jìn)樣體積:10 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,負(fù)離子模式;離子源溫度:500 ℃;電噴霧電壓:-4 500 V;霧化氣流速:55 mL/min;輔助氣流速:55 mL/min;氣簾氣流速:20 mL/min;定量離子對(duì):264.8/264.8;定性離子對(duì):262.8/262.8、266.8/266.8和268.8/268.8,去簇電壓(DP): -110 V;碰撞能量(CE): -5 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件

五氯酚是一種氯代酚類(lèi)物質(zhì),為酸性化合物,性質(zhì)穩(wěn)定,質(zhì)譜檢測(cè)采用負(fù)離子模式([M-H]-)可獲得較高的靈敏度。五氯酚分子離子([M-H]-)在三重四極桿碰撞室中不易被打碎,難以獲得特征子離子。五氯酚具有5個(gè)氯原子,氯元素存在35Cl與37Cl同位素,因此采用氯的4個(gè)同位素母離子對(duì)(262.8/262.8、264.8/264.8、266.8/266.8, 268.8/268.8)作為定性定量離子對(duì),以獲得4個(gè)識(shí)別點(diǎn),滿足確證要求[18]。

在ESI-模式下以流動(dòng)注射方式對(duì)五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描,優(yōu)化去簇電壓,由于采用氯的4個(gè)同位素母離子對(duì),因此碰撞能量采用最低值-5 eV。

2.1.2色譜條件

五氯酚的pKa為4.93,當(dāng)溶液的pH>4.93時(shí),一部分五氯酚以離子態(tài)存在,在流動(dòng)相中加入甲酸能夠降低溶液pH值,使五氯酚以分子形式存在,并可降低色譜柱殘余硅羥基的活性,從而降低目標(biāo)化合物與硅羥基的次級(jí)相互作用,獲得較好的色譜峰形。加入乙酸銨可提高目標(biāo)化合物的離子化效率,從而提高靈敏度;同樣條件下有機(jī)相采用甲醇較乙腈響應(yīng)值提高了1倍,因此采用含5 mmol/L乙酸銨的0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相。

分別采用Waters Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱對(duì)五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,比較五氯酚在T3柱及C18柱的響應(yīng)值及色譜峰形。結(jié)果表明,采用T3色譜柱時(shí)五氯酚的響應(yīng)值比C18柱高38%。因此本文采用Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱。

五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/L)的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1,可見(jiàn)其4個(gè)同位素離子峰的豐度比與理論值(3∶5∶3∶1)[12]一致。

圖 1 五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatogram of pentachlorophenol standard solution (0.5 μg/L)

2.2 提取溶劑及提取方式的選擇

2.2.1提取溶劑

動(dòng)物組織內(nèi)部分五氯酚是以結(jié)合態(tài)形式存在[12],提取前需經(jīng)水解(酸解[5,15,16]和堿解[7,11,12,16])或酶解使結(jié)合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài),但酶解后通常基質(zhì)更復(fù)雜[16,17]。豬肉基質(zhì)分別采用1%(v/v)乙酸甲醇、1%(v/v)乙酸乙腈按1.3節(jié)進(jìn)行提取及旋蒸濃縮。采用1%(v/v)乙酸甲醇提取液旋蒸至近干時(shí)，肉眼可見(jiàn)雞心瓶壁上掛滿油滴;采用1%(v/v)乙酸乙腈提取液旋蒸至近干時(shí)，雞心瓶壁未見(jiàn)油滴。采用1%(v/v)乙酸甲醇提取,在1 μg/kg添加水平下五氯酚回收率低于50%,定性定量離子色譜峰信噪比小于10;乙腈可以沉淀蛋白質(zhì),共提取干擾物較甲醇少,與水能分層,便于后續(xù)凈化。

五氯酚鈉易溶于水,加酸酸化至pH 6.6～6.8時(shí)全部析出為五氯酚[19],分子態(tài)的五氯酚難溶于水,溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑,結(jié)合五氯酚及其鈉鹽的理化性質(zhì),采用1%(v/v)乙酸乙腈先均質(zhì)或渦旋1 min,使五氯酚鈉轉(zhuǎn)化為五氯酚,然后進(jìn)行酸解及超聲提取。采用1%(v/v)乙酸乙腈溶劑還可降低提取液的pH值,使五氯酚以分子形式析出,提高其在乙腈中的分配率。

2.2.2提取方式

比較了均質(zhì)(或渦旋)提取與超聲提取的提取效率,發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)均質(zhì)或渦旋后再超聲提取可明顯提高提取率,僅一次超聲提取,回收率低于55%,而兩次超聲提取后回收率提高至65%以上。因此采用均質(zhì)或渦旋后再超聲提取兩次的提取方式。

2.3 分散吸附劑的選擇和優(yōu)化

動(dòng)物源食品相對(duì)于植物源食品、土壤而言,具有高脂肪、高蛋白質(zhì)含量等特點(diǎn),基質(zhì)復(fù)雜,在優(yōu)化前處理?xiàng)l件時(shí)不僅需要考慮目標(biāo)化合物的提取效率,還要盡量提高對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的去除率,避免過(guò)高的基質(zhì)效應(yīng)。

常用的分散吸附劑有C18、PSA、石墨化炭黑(GCB)和Z-Sep+等[13-17,20-23]。C18吸附劑在硅膠上鍵合了十八烷基官能團(tuán),對(duì)非極性干擾物具有較好去除效果；PSA吸附劑在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團(tuán),可吸附酸性化合物[13,14,23]; GCB能吸附具有平面結(jié)構(gòu)的化合物;Z-Sep+即鍵合C18烷基鏈及二氧化鋯的硅膠,對(duì)脂肪具有較好的去除能力[20-22]。

本文選用豬肉基質(zhì),以回收率和基質(zhì)效應(yīng)為指標(biāo)考察了200 mg MgSO4結(jié)合其他4種分散吸附劑組合(①400 mg Z-Sep+、②200 mg C18+200 mg Z-Sep+、③300 mg C18+100 mg Z-Sep+、④400 mg C18)的凈化效果。在2 μg/kg添加水平下,按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理,分別采用以上4種分散吸附劑組合進(jìn)行凈化。測(cè)得的回收率結(jié)果分別為42.6%、46.8%、52.3%和72.4%,可見(jiàn)隨著Z-Sep+用量的增加,五氯酚的回收率逐漸降低,表明本文條件下Z-Sep+對(duì)五氯酚有吸附作用。采用C18凈化,回收率達(dá)到72.4%,滿足檢測(cè)技術(shù)要求。

分別采用以上4種分散吸附劑組合凈化的提取液,按1.2節(jié)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,并配制相應(yīng)的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照以下公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME), ME=[(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率)-1]×100%。測(cè)得的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果分別為-30%、-36%、-32%和-13%,采用Z-Sep+及Z-Sep+與C18混合物凈化,均表現(xiàn)為中等強(qiáng)度基質(zhì)抑制效應(yīng)[24];采用400 mg C18凈化表現(xiàn)為弱基質(zhì)抑制效應(yīng),且凈化效果最佳。

進(jìn)一步優(yōu)化C18的使用量,發(fā)現(xiàn)當(dāng)C18使用量為200 mg或300 mg時(shí),ME值分別為-21%和-18%。因此確定采用400 mg C18和200 mg無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行分散固相萃取凈化。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

在液相色譜-質(zhì)譜分析中,由共流出干擾物引起的基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響分析方法的靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度。降低基質(zhì)效應(yīng)的方法包括稀釋樣品溶液、增加凈化步驟、優(yōu)化色譜分離條件、采用同位素內(nèi)標(biāo)物、配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液等[24]。本文對(duì)6種基質(zhì)按1.2節(jié)描述配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)得的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)除了豬肝表現(xiàn)為中等強(qiáng)度基質(zhì)抑制效應(yīng)(20%≤|ME|≤50%)[24]外,其余5種樣品均表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)(|ME|<20%)。牛奶及雞蛋較其他4種基質(zhì)具有較高的水分含量,因此顯示較低的基質(zhì)效應(yīng)。本文通過(guò)優(yōu)化凈化方法及色譜分離條件降低基質(zhì)效應(yīng),采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng),有效保證了定性、定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

加標(biāo)豬肝樣品(1.0 μg/kg)的提取離子色譜圖見(jiàn)圖2,可見(jiàn)豬肝基質(zhì)在定量限添加水平下,目標(biāo)化合物仍能獲得較高響應(yīng)值。

圖 2 加標(biāo)豬肝樣品中五氯酚(1.0 μg/kg)的提取離子色譜圖Fig. 2 Extraction ion chromatograms of pentachlorophenol (1.0 μg/kg) spiked in pork liver sample

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

對(duì)豬肉、豬肝、雞肉、魚(yú)肉、牛奶、雞蛋樣品進(jìn)行前處理,按1.2節(jié)描述配制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明,在0.5～5.0 μg/L范圍內(nèi)6種基質(zhì)中五氯酚的質(zhì)量濃度(x, μg/L)與對(duì)應(yīng)的峰面積(y)呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)為0.996 7～0.999 9(見(jiàn)表1)。

在豬肉、豬肝、雞肉、魚(yú)肉、牛奶、雞蛋樣品中各添加1.0、2.0、10.0 μg/kg水平的五氯酚,進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次。6種基質(zhì)中五氯酚的加標(biāo)回收率為73.2%～108.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～14.8%(見(jiàn)表1)。

以1.0 μg/kg加標(biāo)樣品定量離子對(duì)色譜信號(hào)的3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限,為0.1 μg/kg,以S/N>10確定方法的定量限,為1.0 μg/kg,符合相關(guān)法規(guī)要求[1,2,11]。

表 1 6種基質(zhì)中五氯酚的基質(zhì)效應(yīng)、回歸方程,相關(guān)系數(shù)、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.6 實(shí)際樣品分析

分別從超市購(gòu)買(mǎi)豬肉、豬肝、雞肉、魚(yú)肉、牛奶、雞蛋樣品各2份,按本文方法進(jìn)行分析,2份豬肝樣品均檢出微量五氯酚,但含量均低于定量限,其余樣品均未檢出五氯酚。

3 結(jié)論

本工作建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS測(cè)定動(dòng)物源食品中痕量五氯酚及其鈉鹽的分析方法。該法操作簡(jiǎn)單,環(huán)保,快速準(zhǔn)確,技術(shù)指標(biāo)滿足殘留分析及法規(guī)要求。

參考文獻(xiàn):

[1] Ministry of Agriculture. No 235 Bulletin of the Ministry of Agriculture of People’s Republic of China (2002-12-24) [2018-02-21]. http://www.moa.gov.cn/gk/tzgg-1/gg/200302/t20030226-59300.htm

農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào). (2002-12-24) [2018-02-21]. http://www.moa.gov.cn/gk/tzgg-1/gg/200302/t20030226-59300.htm

[2] China Food and Drug Administration. Enforcement Regulation for National Food Safety Spot-Check Supervision (2018 Edition). (2018-01-24) [2018-02-21]. http://www. sda. gov. cn/WS01/CL1605/223270. html

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局. 國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則(2018年版).(2018-01-24) [2018-02-21]. http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1605/223270.html

[3] Li X Q, Guan Q, Wang L, et al. Journal of South China Agricultural University, 2012, 33(2): 253

李小橋, 官瓊, 王林, 等. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 33(2): 253

[4] Neidert E, Saschenbrecker P W, Patterson J R. J Environ Sci Health, 1984, B19(7): 579

[5] Shi Y K, Yang M G, Yang Q H, et al. Chinese Journal of Food Hygiene, 2015, 27(1): 19

史玉坤, 楊梅桂, 楊清華, 等. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2015, 27(1): 19

[6] Jiang X L, Liu M H, Xu Z H, et al. Leather and Chemicals, 2016, 33(4): 12

蔣小良, 劉敏慧, 徐正華, 等. 皮革與化工, 2016, 33(4): 12

[7] GB 29708-2013

[8] Wang Y N, Niu S T, He X W, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2010, 29(4): 73

王亞男, 牛書(shū)濤, 賀小蔚, 等. 分析試驗(yàn)室, 2010, 29(4): 73

[9] Stehly G R, Hayton W L. J Environ Sci Health, 1988, B23(4): 355

[10] Zhang P, Su F H, Dai X H, et al. Chemistry, 2010(11): 1045

張盼, 蘇福海, 戴新華, 等. 化學(xué)通報(bào), 2010(11): 1045

[11] GB 23200.92-2016

[12] Pan S D, Chen X H, He Q, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(12): 1245

潘勝東, 陳曉紅, 何仟, 等. 色譜, 2017, 35(12): 1245

[13] Anastassiades M, Lehotay S J, Stajnbaher D, et al. J AOAC Int, 2003, 86(2): 412

[14] Lehotay S J, Ae S K, Kwon H, et al. J Chromatogr A, 2010, 1217: 2548

[15] Zhu P P, Yue Z F, Zheng Z K, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(5): 494

朱萍萍, 岳振峰, 鄭宗坤, 等. 色譜, 2015, 33(5): 494

[16] Zhang Y, Yue Z F, Lan F, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2012, 40(5): 724

張毅, 岳振峰, 藍(lán)芳, 等. 分析化學(xué), 2012, 40(5): 724

[17] Luo H T, Huang X L, Wu H Q, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(5): 481

羅輝泰, 黃曉蘭, 吳惠勤, 等. 色譜, 2016, 34(5): 481

[18] 2002/657/EC

[19] Zhu H F. A Handbook of Usual Crude Material for Fine Chemical Industry. Beijing: Jin Dun Press, 2003: 1099

朱洪法. 精細(xì)化工常用原材料手冊(cè). 北京: 金盾出版社, 2003: 1099

[20] Sapozhnikova Y, Lehotay S J. Anal Chim Acta, 2013, 758: 80

[21] Wang L Z, Huang X Y, Wang D F, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(5): 501

王連珠, 黃小燕, 王登飛, 等. 色譜, 2015, 33(5): 501

[22] Wang L Z, Li X L, Fang E F, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(7): 686

王連珠, 李曉蓮, 方恩華, 等. 色譜, 2016, 34(7): 686

[23] Wang L Z, Huang X Y, Chen Y, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2014, 33(10): 1102

王連珠, 黃小燕, 陳泳, 等. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2014, 33(10): 1102

[24] González O, Blanco M E, Iriarte G, et al. J Chromatogr A, 2014, 1353: 10