王連珠, 方恩華, 王彩娟, 陳 泳, 林子旭, 徐敦明

(1. 漳州出入境檢驗檢疫局, 福建 漳州 363100; 2. 廈門出入境檢驗檢疫局, 福建 廈門 361012)

五氯酚及其鈉鹽屬高毒有機氯農(nóng)藥,具有致畸、致癌、致突變等毒副作用,曾作為除草劑、殺菌劑、防腐劑、生物殺滅劑等在世界范圍內(nèi)廣泛應用。五氯酚化學性質(zhì)穩(wěn)定,殘留期長,可通過生物富集進入食物鏈;五氯酚鈉具有較高的水溶性,易通過水載體廣泛擴散,從而影響生態(tài)安全并產(chǎn)生生物蓄積。農(nóng)業(yè)部公告第235號[1]規(guī)定所有食品動物禁用五氯酚鈉,在動物源食品中不得檢出。為進一步規(guī)范食品安全監(jiān)督抽檢工作,《國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細則(2018年版)》明確規(guī)定了畜禽肉及其副產(chǎn)品檢測五氯酚鈉項目[2]。

目前五氯酚及其鈉鹽的分析方法有氣相色譜法(GC)[3,4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-7]、液相色譜法(LC)[8,9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10,11]和超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(UPLC-HRMS)[12]。GC和GC-MS需柱前衍生,操作繁瑣;LC靈敏度不高,且定性能力差;LC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性強、前處理簡單的特點,目前廣泛應用于五氯酚的測定[10,11]。

食品中五氯酚的前處理方法有液液萃取法(LLE)[3-5,7]和固相萃取法(SPE)[11,12],但以上方法試劑使用量大,操作繁瑣。QuEChERS前處理方法于2003年由Anastassiades等[13]首次提出,如今已成為果蔬中農(nóng)藥多殘留分析的首選方法及分散固相萃取(d-SPE)的“模板”方法[14], QuEChERS可根據(jù)分析物的理化性質(zhì)及基質(zhì)種類選擇不同的分散吸附劑。目前采用QuEChERS分析動物源食品中藥物殘留的檢測方法也有許多報道[15-17],但未有采用QuEChERS分析動物源食品中五氯酚的報道。

本文采用改良的QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS分析技術(shù),建立了動物源食品中痕量五氯酚及其鈉鹽的快速測定方法。該法效率高,操作簡單,滿足殘留分析及法規(guī)要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC-30A超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); API 5500Q三重四極桿/復合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司); GM 200碾磨儀(德國Retsch公司); T25高速分散機(德國IKA公司); KQ-500 DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); 3-30K高速冷凍離心機(德國Sigma公司); Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)大儀器廠); Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)。

五氯酚標準溶液(0.997 mg/mL,溶于甲醇)購自中國計量科學研究院。碳十八鍵合鋯膠(Z-Sep+)分散吸附劑(美國Supelco公司); C18吸附劑(40 μm,美國Agilent公司);無水硫酸鎂(MgSO4)、乙酸銨均為分析純(上海國藥集團);甲醇、乙腈均為色譜純(德國Merck公司);甲酸、乙酸均為色譜純(美國Fluka公司)。實驗用水均為經(jīng)Milli-Q超純水器純化的超純水。豬肉、豬肝、雞肉、魚肉、牛奶、雞蛋樣品購自當?shù)爻小?/p>

1.2 標準溶液的配制

準確移取適量五氯酚標準溶液,用乙腈稀釋并配制標準工作液;用乙腈-水(1∶1, v/v)配制0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/L系列標準工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

移取0.5 mL空白樣品提取液6份,分別置于2 mL離心管中,加入20 μg/L五氯苯酚標準溶液0、25、50、100、150、250 μL,再加入500、475、450、400、350、250 μL水,混勻過濾,配制0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/L基質(zhì)匹配標準溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

稱取2.00 g均質(zhì)樣品,置于50 mL具塞離心管中,加入1%(v/v)乙酸乙腈溶液10 mL,高速均質(zhì)(或渦旋)1 min,加入400 mg無水硫酸鎂,超聲提取20 min,以9 500 r/min離心5 min,取上清液,殘渣加入1%(v/v)乙酸乙腈溶液10 mL,重復提取1次,合并提取液,旋蒸濃縮至近干,加入2.0 mL乙腈溶解,轉(zhuǎn)移至裝有200 mg MgSO4、400 mg C18的離心管中,渦旋30 s,以9 500 r/min離心5 min,移取0.5 mL凈化液,置于2 mL離心管中,加入0.5 mL水,混勻過濾,供UPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A相為含5 mmol/L乙酸銨的0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1 min, 25%B, 1～4 min, 25%B～95%B; 4～6 min, 95%B; 6～7 min, 95%B～25%B; 7～9 min, 25%B。進樣體積:10 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,負離子模式;離子源溫度:500 ℃;電噴霧電壓:-4 500 V;霧化氣流速:55 mL/min;輔助氣流速:55 mL/min;氣簾氣流速:20 mL/min;定量離子對:264.8/264.8;定性離子對:262.8/262.8、266.8/266.8和268.8/268.8,去簇電壓(DP): -110 V;碰撞能量(CE): -5 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件

五氯酚是一種氯代酚類物質(zhì),為酸性化合物,性質(zhì)穩(wěn)定,質(zhì)譜檢測采用負離子模式([M-H]-)可獲得較高的靈敏度。五氯酚分子離子([M-H]-)在三重四極桿碰撞室中不易被打碎,難以獲得特征子離子。五氯酚具有5個氯原子,氯元素存在35Cl與37Cl同位素,因此采用氯的4個同位素母離子對(262.8/262.8、264.8/264.8、266.8/266.8, 268.8/268.8)作為定性定量離子對,以獲得4個識別點,滿足確證要求[18]。

在ESI-模式下以流動注射方式對五氯酚標準溶液進行母離子全掃描,優(yōu)化去簇電壓,由于采用氯的4個同位素母離子對,因此碰撞能量采用最低值-5 eV。

2.1.2色譜條件

五氯酚的pKa為4.93,當溶液的pH>4.93時,一部分五氯酚以離子態(tài)存在,在流動相中加入甲酸能夠降低溶液pH值,使五氯酚以分子形式存在,并可降低色譜柱殘余硅羥基的活性,從而降低目標化合物與硅羥基的次級相互作用,獲得較好的色譜峰形。加入乙酸銨可提高目標化合物的離子化效率,從而提高靈敏度;同樣條件下有機相采用甲醇較乙腈響應值提高了1倍,因此采用含5 mmol/L乙酸銨的0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇作為流動相。

分別采用Waters Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)色譜柱對五氯酚標準溶液進行分析,比較五氯酚在T3柱及C18柱的響應值及色譜峰形。結(jié)果表明,采用T3色譜柱時五氯酚的響應值比C18柱高38%。因此本文采用Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱。

五氯酚標準溶液(0.5 μg/L)的提取離子色譜圖見圖1,可見其4個同位素離子峰的豐度比與理論值(3∶5∶3∶1)[12]一致。

圖 1 五氯酚標準溶液(0.5 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatogram of pentachlorophenol standard solution (0.5 μg/L)

2.2 提取溶劑及提取方式的選擇

2.2.1提取溶劑

動物組織內(nèi)部分五氯酚是以結(jié)合態(tài)形式存在[12],提取前需經(jīng)水解(酸解[5,15,16]和堿解[7,11,12,16])或酶解使結(jié)合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài),但酶解后通?；|(zhì)更復雜[16,17]。豬肉基質(zhì)分別采用1%(v/v)乙酸甲醇、1%(v/v)乙酸乙腈按1.3節(jié)進行提取及旋蒸濃縮。采用1%(v/v)乙酸甲醇提取液旋蒸至近干時，肉眼可見雞心瓶壁上掛滿油滴;采用1%(v/v)乙酸乙腈提取液旋蒸至近干時，雞心瓶壁未見油滴。采用1%(v/v)乙酸甲醇提取,在1 μg/kg添加水平下五氯酚回收率低于50%,定性定量離子色譜峰信噪比小于10;乙腈可以沉淀蛋白質(zhì),共提取干擾物較甲醇少,與水能分層,便于后續(xù)凈化。

五氯酚鈉易溶于水,加酸酸化至pH 6.6～6.8時全部析出為五氯酚[19],分子態(tài)的五氯酚難溶于水,溶于大多數(shù)有機溶劑,結(jié)合五氯酚及其鈉鹽的理化性質(zhì),采用1%(v/v)乙酸乙腈先均質(zhì)或渦旋1 min,使五氯酚鈉轉(zhuǎn)化為五氯酚,然后進行酸解及超聲提取。采用1%(v/v)乙酸乙腈溶劑還可降低提取液的pH值,使五氯酚以分子形式析出,提高其在乙腈中的分配率。

2.2.2提取方式

比較了均質(zhì)(或渦旋)提取與超聲提取的提取效率,發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)均質(zhì)或渦旋后再超聲提取可明顯提高提取率,僅一次超聲提取,回收率低于55%,而兩次超聲提取后回收率提高至65%以上。因此采用均質(zhì)或渦旋后再超聲提取兩次的提取方式。

2.3 分散吸附劑的選擇和優(yōu)化

動物源食品相對于植物源食品、土壤而言,具有高脂肪、高蛋白質(zhì)含量等特點,基質(zhì)復雜,在優(yōu)化前處理條件時不僅需要考慮目標化合物的提取效率,還要盡量提高對復雜基質(zhì)中脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的去除率,避免過高的基質(zhì)效應。

常用的分散吸附劑有C18、PSA、石墨化炭黑(GCB)和Z-Sep+等[13-17,20-23]。C18吸附劑在硅膠上鍵合了十八烷基官能團,對非極性干擾物具有較好去除效果；PSA吸附劑在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團,可吸附酸性化合物[13,14,23]; GCB能吸附具有平面結(jié)構(gòu)的化合物;Z-Sep+即鍵合C18烷基鏈及二氧化鋯的硅膠,對脂肪具有較好的去除能力[20-22]。

本文選用豬肉基質(zhì),以回收率和基質(zhì)效應為指標考察了200 mg MgSO4結(jié)合其他4種分散吸附劑組合(①400 mg Z-Sep+、②200 mg C18+200 mg Z-Sep+、③300 mg C18+100 mg Z-Sep+、④400 mg C18)的凈化效果。在2 μg/kg添加水平下,按1.3節(jié)方法進行前處理,分別采用以上4種分散吸附劑組合進行凈化。測得的回收率結(jié)果分別為42.6%、46.8%、52.3%和72.4%,可見隨著Z-Sep+用量的增加,五氯酚的回收率逐漸降低,表明本文條件下Z-Sep+對五氯酚有吸附作用。采用C18凈化,回收率達到72.4%,滿足檢測技術(shù)要求。

分別采用以上4種分散吸附劑組合凈化的提取液,按1.2節(jié)配制基質(zhì)匹配標準溶液,并配制相應的純?nèi)軇藴嗜芤?繪制標準曲線,按照以下公式計算基質(zhì)效應(ME), ME=[(基質(zhì)匹配標準曲線斜率/純?nèi)軇藴是€斜率)-1]×100%。測得的基質(zhì)效應結(jié)果分別為-30%、-36%、-32%和-13%,采用Z-Sep+及Z-Sep+與C18混合物凈化,均表現(xiàn)為中等強度基質(zhì)抑制效應[24];采用400 mg C18凈化表現(xiàn)為弱基質(zhì)抑制效應,且凈化效果最佳。

進一步優(yōu)化C18的使用量,發(fā)現(xiàn)當C18使用量為200 mg或300 mg時,ME值分別為-21%和-18%。因此確定采用400 mg C18和200 mg無水硫酸鎂進行分散固相萃取凈化。

2.4 基質(zhì)效應

在液相色譜-質(zhì)譜分析中,由共流出干擾物引起的基質(zhì)效應會影響分析方法的靈敏度、精密度及準確度。降低基質(zhì)效應的方法包括稀釋樣品溶液、增加凈化步驟、優(yōu)化色譜分離條件、采用同位素內(nèi)標物、配制基質(zhì)匹配標準溶液等[24]。本文對6種基質(zhì)按1.2節(jié)描述配制基質(zhì)匹配標準溶液,測得的基質(zhì)效應結(jié)果見表1?？梢姵素i肝表現(xiàn)為中等強度基質(zhì)抑制效應(20%≤|ME|≤50%)[24]外,其余5種樣品均表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(|ME|<20%)。牛奶及雞蛋較其他4種基質(zhì)具有較高的水分含量,因此顯示較低的基質(zhì)效應。本文通過優(yōu)化凈化方法及色譜分離條件降低基質(zhì)效應,采用基質(zhì)匹配標準曲線補償基質(zhì)效應,有效保證了定性、定量結(jié)果的準確性。

加標豬肝樣品(1.0 μg/kg)的提取離子色譜圖見圖2,可見豬肝基質(zhì)在定量限添加水平下,目標化合物仍能獲得較高響應值。

圖 2 加標豬肝樣品中五氯酚(1.0 μg/kg)的提取離子色譜圖Fig. 2 Extraction ion chromatograms of pentachlorophenol (1.0 μg/kg) spiked in pork liver sample

2.5 方法學評價

對豬肉、豬肝、雞肉、魚肉、牛奶、雞蛋樣品進行前處理,按1.2節(jié)描述配制基質(zhì)匹配校準溶液。結(jié)果表明,在0.5～5.0 μg/L范圍內(nèi)6種基質(zhì)中五氯酚的質(zhì)量濃度(x, μg/L)與對應的峰面積(y)呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)為0.996 7～0.999 9(見表1)。

在豬肉、豬肝、雞肉、魚肉、牛奶、雞蛋樣品中各添加1.0、2.0、10.0 μg/kg水平的五氯酚,進行加標回收率試驗,每個添加水平重復測定6次。6種基質(zhì)中五氯酚的加標回收率為73.2%～108.4%,相對標準偏差為4.0%～14.8%(見表1)。

以1.0 μg/kg加標樣品定量離子對色譜信號的3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限,為0.1 μg/kg,以S/N>10確定方法的定量限,為1.0 μg/kg,符合相關(guān)法規(guī)要求[1,2,11]。

表 1 6種基質(zhì)中五氯酚的基質(zhì)效應、回歸方程,相關(guān)系數(shù)、回收率和相對標準偏差(n=6)

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.6 實際樣品分析

分別從超市購買豬肉、豬肝、雞肉、魚肉、牛奶、雞蛋樣品各2份,按本文方法進行分析,2份豬肝樣品均檢出微量五氯酚,但含量均低于定量限,其余樣品均未檢出五氯酚。

3 結(jié)論

本工作建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS測定動物源食品中痕量五氯酚及其鈉鹽的分析方法。該法操作簡單,環(huán)保,快速準確,技術(shù)指標滿足殘留分析及法規(guī)要求。

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