梁楓萍,程 鵬

(1.廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院腫瘤血液科 537000; 2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液內科,南寧 530021)

遺傳性凝血因子V(FV)缺乏癥是一種罕見出血性疾病，由FV結構或功能缺陷導致的常染色體隱性遺傳性疾病。本研究通過凝血功能及FV活性的檢測，確診了1例FV缺乏癥患者，并對其家系成員的FV基因進行測序，以尋找致病突變基因，探討其發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，男，33歲，廣西賓陽人，漢族，自幼無異常出血表現(xiàn)，2014年因不育癥就診。查體：無陽性體征。實驗室檢查：凝血酶原時間(PT)38.7 s、活化部分凝血活酶時間(APTT)133.3 s ；凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB)正常；FV促凝活性(FV∶C) 0.6%，其他凝血因子活性正常；血常規(guī)、肝功能正常。先證者父母，廣西賓陽人，非近親婚配；對先證者的直系家系成員包括先證者父親、母親、妹妹均進行凝血功能及基因檢測。家系成員中無皮膚、牙齦出血或外傷后出血不止等出血及出血傾向，家系成員血常規(guī)、肝功能均正常，未曾使用抗凝劑。本研究經廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準并征得先證者及其家系成員知情同意。家系圖見圖1。

圖1 遺傳性凝血因子Ⅴ家系圖

1.2方法

1.2.1實驗儀器 PCR反應擴增儀(東勝龍)，3130xl測序列分析儀(美國ABI公司)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)，DYCP-31E型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一)，YXJ-2離心機(湘儀離心機儀器有限公司)，H6-1微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Gene Genius公司)，移液器(范圍100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL)(德國Eppendorf公司)。

1.2.2主要試劑 Phusion Hot Start Ⅱ High-Fidelity DNA Polymerase(美國Thermo公司F-549S)；Marker、6×DNA Loading Dye(上海生工生物技術有限公司)；PCR產物純化回收試劑盒(上海生工生物技術有限公司SK1141)；10×TAE(400 mmol/L Tris-acetate and 10 mmol/L EDTA，pH 8.0)。

1.2.3標本采集和處理 所有研究對象抽取外周靜脈血4 mL，EDTA抗凝，標本分2份，分別用于凝血功能分析及DNA提取。DNA提取后進行濃度和純度測定，將DNA分裝并凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4凝血功能分析 對先證者及家系成員進行PT、APTT、FⅡ∶C、FV∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C測定。

1.2.5引物設計 參照文獻[1]設計了30對引物(表1)，由上海生工生物技術有限公司合成。

表1 PCR引物序列表

續(xù)表1 PCR引物序列表

1.2.6PCR擴增 PCR反應系為20 μL，包括10 μL PCR Mix ，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，超純水7 μL。在DNA熱循環(huán)儀上進行PCR擴增，反應條件如下：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)35次，最后72 ℃再延伸5～8 min。取PCR產物5 μL上樣于1.8%瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液中100 mV電壓電泳30 min后，將凝膠置于數(shù)字化凝膠成像分析儀內拍照分析。

表2 遺傳性凝血因子V缺乏癥家系成員凝血指標檢測結果

1.2.7PCR擴增產物純化及測序 PCR擴增產物回收純化，嚴格按純化試劑盒說明書操作，純化產物進行直接測序。以美國NCBI基因庫公布的序列AY364535為標準，采用Chroma軟件對測序結果進行分析比對，尋找基因變異位點。變異位點與NCBI中的SNP數(shù)據(jù)庫比對，確定是否存在人群基因多態(tài)性。最后對異常測序結果重新進行PCR擴增及正向、反向測序，進一步確定基因突變。

2 結 果

2.1凝血功能檢測結果 先證者及其妹妹APTT、PT明顯延長，先證者FⅤ∶C 0.6%，妹妹FⅤ∶C 0.3%，母親FⅤ∶C 27.4%；先證者及其家系成員FⅡ∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C均在正常范圍內,見表2。

2.2測序結果 先證者FⅤ基因存在1個雜合錯義突變G16088C(Asp68His)；8個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點突變，雜合錯義突變A38529G(Arg485Lys)，純合錯義突變A58668G(Met1736Val)、A45888G(Lys830Arg)、A45909G(His837Arg)、A46088G(Lys897Glu)、純合同義突變C45523T(Ile708Ile)、T45550C(Asn717Asn)、A45616G (Ser739Ser)；先證者妹妹的基因型與先證者完全一致；先證者父親不存在雜合錯義突變G16088C(Asp68His)，8個SNP位點均為雜合突變。先證者母親存在雜合錯義突變G16088C(Asp68His)，8個SNP位點均為雜合突變。這些SNP位點與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫記錄的相一致，見表3、圖2～5。

表3 先證者及其家系成員FⅤ基因突變位點

核苷酸位點參照Genbank序列，AY364535；+：純合突變；±：雜合突變；-：無突變

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖2先證者第3外顯子正向測序結果

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖3先證者妹妹第3外顯子正向測序結果

箭頭示存在G16088C雜合子突變

圖4先證者母親第3外顯子正向測序結果

箭頭示相同位點與野生型一致

圖5先證者父親第3外顯子正向測序結果

3 討 論

FⅤ缺乏癥是由FⅤ結構或功能缺陷導致的常染色體隱性遺傳性疾病。患者常表現(xiàn)為皮膚黏膜出血、月經過多、創(chuàng)傷出血不止，但肌肉和關節(jié)出血少見，顱腦出血更是罕見[2]。凝血篩查實驗PT、APTT延長，即刻及孵育APTT糾正實驗可排除狼瘡抗凝物及FⅧ因子抗體，進一步行FⅤ∶C測定具有診斷意義?；蚍治鲆话阍谂R床研究中進行，且由于傳統(tǒng)基因測序技術的局限性，5%～10%患者的基因突變無法檢測出來[3]，因此FⅤ∶C輕度下降的雜合突變患者，明確診斷仍面臨著挑戰(zhàn)。FⅤ缺乏癥分為兩型:Ⅰ型是FⅤ抗原(FⅤ∶Ag)和FⅤ∶C同步下降;Ⅱ型是FⅤ蛋白異常所致,呈FⅤ∶Ag正常而FⅤ∶C降低，或者FⅤ∶Ag和FⅤ∶C下降不平行。

成熟的FⅤ由2 196個氨基酸構成，分為5個功能區(qū)，即A1-A2-B-A3-C1-C2?；罨腇Ⅴ(FⅤa)是異二聚體，重鏈區(qū)包括A1、A2及NH2端，輕鏈區(qū)包括A3、C1、C2及羧基端，通過二價金屬離子(2個Ca2+和一個Cu2+)非共價聯(lián)結[4-6]。編碼人類FⅤ的基因定位于1 號染色體q24.2，含25個外顯子及24個內含子。第1～12外顯子編碼信號肽和A1-A2區(qū),第13外顯子編碼B區(qū),14～25外顯子編碼A3、C1和C2區(qū)。

目前已發(fā)現(xiàn)了約160種與FⅤ缺乏癥有關的基因突變，包括無義突變、錯義突變、刪除、插入、剪切位點突變。錯義突變通常引起單個氨基酸置換，影響了FⅤ的折疊和構象改變，分泌途徑的質量控制系統(tǒng)將其滯留在細胞內，導致細胞內降解和分泌障礙[7]，這是大部分錯義突變導致FⅤ∶Ag和FⅤ∶C同步降低的Ⅰ型FⅤ缺乏癥的機制。少數(shù)錯義突變(His147Arg、Tyr91Asn、Ala221Val和His147Arg)[8-9]，影響了二價金屬離子Cu2+的結合位點[9]、A1-A2-A3結構域的相互作用，導致了輕鏈和重鏈的相對分離，影響了FⅤa的穩(wěn)定性，從而導致FⅤ∶Ag和FⅤ∶C非同步下降的Ⅱ型FⅤ缺乏癥。雖然大部分的錯義突變位于A2和C2結構域，但越來越多發(fā)生在A1結構域的錯義突變被證實[10]。A1結構域是FⅤa和活化的FⅩ(FⅩa)相互反應的重要區(qū)域，此外，A1結構域存在重鏈與二價金屬離子Ca2+相互作用的位點，影響著FⅤa的輕鏈和重鏈的相互聯(lián)結[11]。因此，發(fā)生在A1結構域的突變不僅導致Ⅰ型FⅤ缺乏癥，也導致Ⅱ型FⅤ缺乏癥[12-13]。

曹麗娟等[1]通過分子建模分析發(fā)現(xiàn)，Asp68His突變發(fā)生后，維持A1區(qū)β片層結構的氫鍵及分子表面范德華力發(fā)生偏移，降低了分子結構的穩(wěn)定性，從而影響FⅤ-Asp68His突變蛋白的折疊、細胞內轉運、分泌。

2014年臺灣國立成功大學的學者對FⅤ-Asp68His蛋白進行了體外表達研究證實，Asp68His突變導致了FⅤ分泌障礙，且FⅤ細胞內降解增強，從而引起FⅤ∶Ag和FⅤ∶C同步下降[14]。

本研究中，先證者自幼無異常出血表現(xiàn)，因不育癥就診檢查發(fā)現(xiàn)PT 38.7 s、APTT 133.3 s，F(xiàn)Ⅴ∶C僅0.6%，排除了肝病等獲得性因素導致的FⅤ∶C減低，且先證者母親和妹妹FⅤ∶C均降低，臨床診斷FⅤ缺乏癥明確?；驕y序結果顯示先證者及其母親、妹妹均存在雜合錯義突變G16088C(Asp68His)，家系分析表明先證者母親及妹妹均是Asp68His雜合錯義突變(圖2、3、4)，而父親相同位點與野生型一致(圖5)，提示該突變遺傳自母親，因此，基因水平診斷FⅤ缺乏癥明確。Asp68His突變是本研究中先證者及其妹妹、母親FⅤ∶C下降的主要原因。

先證者及其母親、妹妹基因突變類型均為雜合錯義突變，但三者的FⅤ∶C差異較大。對目前文獻報道的Asp68His突變FⅤ缺乏癥家系數(shù)據(jù)分析也發(fā)現(xiàn)FⅤ∶C水平的差異[1，15]，4個Asp68His雜合子的FⅤ∶C波動在45%～63%，1個Asp68His純合子突變的FⅤ∶C 5%，提示純合子突變患者的FⅤ∶C較雜合子突變下降明顯。本研究的先證者和其母親、妹妹都是Asp68His突變雜合子，但FⅤ∶C下降明顯，與文獻報道不一致，提示有其他的因素影響著FⅤ∶C。2010年黃丹丹等[16]報道的FⅤ缺乏癥患者證實是Asp68His雜合錯義突變，其FⅤ∶C 5%，其基因分析結果發(fā)現(xiàn)了位于同一條染色體上的4個SNP，分別導致了Met413Thr、His1327Arg、Metl764Val和Asp2222Gly突變，其研究結果認為，Asp68His雜合錯義突變和4個SNP共同導致了FⅤ∶C水平下降。YAMAZAKI等[17]的體外表達研究證實這4個多態(tài)性(Met413Thr、His1327Arg、Metl764Val和Asp2222Gly)同時存在時，F(xiàn)Ⅴ的表達水平比野生型顯著降低，約為野生型的20%，其原因是蛋白質合成率明顯降低并伴分泌障礙，其中Asp2222Gly是造成分泌障礙的關鍵因素。本研究的基因分析結果顯示，先證者及其妹妹存在4個純合錯義突變多態(tài)性(Met1736Val、Lys830Arg、His837Arg、Lys897Glu)和1個雜合錯義突變多態(tài)性(Arg485Lys)，先證者母親存在這5個SNP的雜合形式，據(jù)此推斷，這5個SNP的存在影響了FⅤ∶C水平。此外，先證者及其母親、妹妹均存在同義突變C45523T(Ile708Ile)、T45550C (Asn717Asn)、A45616G (Ser739Ser)，突變并未引起編碼氨基酸改變，對FⅤ∶C無影響。

總之，Asp68His突變是導致先證者及其母親、妹妹FⅤ∶C下降的主要原因，Arg485Lys 、Met1736Val、Lys830Arg、His837Arg、Lys897Glu 5種SNP的存在可能影響著FⅤ∶C。這5種SNP下調FⅤ∶C水平的具體機制有待進一步的研究。

[1]曹麗娟，王兆誠．五例遺傳性凝血因子V缺乏癥的基因分析[D]．蘇州：蘇州大學，2007．

[2]LAK M,SHARIFIAN R,PEYVANDI F,et al.Symptoms of inherited factor V deficiency in 35 Iranian patients[J].Br J Haematol,1998,103(4):1067-1069.

[3]PALLA R，PEYVANDI F，SHAPIRO A D.Rare bleeding disorders:diagnosis and treatment[J].Blood,2015,125(13):2052-2061.

[4]KENT W J,SUGNET C W,FUREY T S,et al.The human genome browser at UCSC[J].Genome Res，2002，12(6):996-1006.

[5]MANN K G,KALAFATIS M.Factor V:a combination of Dr Jekyll and Mr Hyde[J].Blood,2003,101(1):20-30.

[6]NICOLAES G A,DAHLBACK B.Factor V and thrombotic disease:description of a janus-faced protein[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(4):530-538.

[7]CAI X H,WANG X F,DING Q L,et al.Factor V C1149G and 5609-10INSCGTGGTT causing factor V deficiency:molecular characterization by in-vitro expression[J].Thromb Haemost,2007,98(3):683-685.

[8]STEEN M,MITEVA M,VILLOUTREIX B O,et al.Factor V New Brunswick:Ala221Val associated with FV deficiency reproduced in vitro and functionally characterized[J].Blood,2003,102(4):1316-1322.

[9]LIU H C,LIN T M,ENG H L,et al.Functional characterization of a novel missense mutation,His147Arg,in A1 domain of FV protein causing type Ⅱ deficiency[J].Thromb Res,2014,134(1):153-159.

[10]VOS H L.An online database of mutations and polymorphisms in and around the coagulation factor V gene[J].J Thromb Haemost,2007,5(1):185-188.

[11]ADAMS T E,HOCKIN M F,MANN K G,et al.The crystal structure of activated protein C-inactivated bovine factor Va:Implications for cofactor function[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(24):8918-8923.

[12]PARABOSCHI E M,KAYIRAN S M,?ZBEK N,et al.Functional characterization of a novel missense mutation identified in a Turkish patient affected by severe coagulation factor V deficiency[J].Haemophilia,2012,18(2):205-210.

[13]DELEV D,PAVLOVA A,HEINZ S,et al.Modelling and expression studies of two novel mutations causing factor V deficiency[J].Thromb Haemost,2008,100(5):766-772.

[14]LIU H C,SHEN M C,ENG H L,et al.Asp68his mutation in the a1 domain of human factor V causes impaired secretion and ineffective translocation[J].Haemophilia,2014,20(4):e318-e326.

[15]CAO L,WANG Z,LI H,et al.Gene analysis and prenatal diagnosis for two families of congenital factor V deficiency[J].Haemophilia,2011,17(1):65-69.

[16]黃丹丹，王學鋒，陳華云，等．四個遺傳性凝血因子V缺陷癥家系臨床表型和基因型變化的研究[J]．中華血液學雜志，2010，31(3)：149-153．

[17]YAMAZAKI T,NICOLAES G A,SRENSEN K W,et al.Molecular basis of quantitative factor V deficiency associated with factor V R2 haplotype[J].Blood,2002,100(7):2515-2521.