朱琳菊,寇煒△,李竺娟,孫少伯,梁冰(.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州730030;.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合系,甘肅蘭州730000)
腫瘤是當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)難題之一,紫杉醇(TAX)為經(jīng)典抗癌藥物,但其在發(fā)揮抗癌作用同時(shí)對腎臟具有一定的損傷作用,近年來,隨著中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,對當(dāng)歸紅芪功效的科學(xué)研究日益增多,當(dāng)歸紅芪超濾物(RASRH)已被證實(shí)具有良好的抗腫瘤作用[1-3]。但有關(guān)其是否對TAX導(dǎo)致的腎足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的文獻(xiàn)報(bào)道較少,為此,本研究借助大鼠腎足細(xì)胞,采用TAX處理,輔以超濾技術(shù)提取純化的RAS-RH干預(yù),利用分子生物學(xué)技術(shù),從凋亡角度出發(fā),研究RAS-RH是否對化療藥物損傷的腎足細(xì)胞具有保護(hù)作用,為其在臨床中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞 大鼠腎足細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。
1.1.2 藥物 中藥紅芪、當(dāng)歸均采自甘肅省岷縣,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定:紅芪是豆科巖黃芪(hedysarum polybotrys hand?Mazz)屬植物多序黃芪的干燥根莖,當(dāng)歸為傘形科植物[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]的干燥根基,RAS-RH參照文獻(xiàn)[4]制作流程和結(jié)果,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心與甘肅省膜科學(xué)技術(shù)研究院聯(lián)合制備。
1.1.3 試劑及儀器 倒置相差顯微鏡為日本OLYMPUS產(chǎn)品,Thermo 311二氧化碳培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品,電動離心機(jī)為金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品,SCS-24搖床為上海市離心機(jī)械研究所產(chǎn)品,精密電子天平為北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品,高糖培養(yǎng)基、0.5%胰蛋白酶、TrizonX-100、胎牛血清、100X青霉素-鏈霉素溶液均為HyClone公司產(chǎn)品,超凈工作臺、流式細(xì)胞儀、16孔細(xì)胞電子檢測板(E-Plate)、實(shí)時(shí)細(xì)胞分析(RTCA)儀均為艾森生物-杭州有限公司產(chǎn)品,TAX(E160101)購自上海譜振生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 RAS-RH的制備 當(dāng)歸、紅芪飲片以1∶5的比例混合,水煎煮2次,過濾水煎液并加熱濃縮后用陶瓷膜微濾濃縮液,技術(shù)參數(shù)為壓力0.2 mPa/m3、溫度25℃、流量10 L/(h·m2);選用截留相對分子質(zhì)量為1×105聚丙烯腈(PNA)中空纖維超濾膜,超濾經(jīng)微濾處理后的當(dāng)歸、紅芪水煎劑濃縮液,技術(shù)參數(shù)為壓力5~6 kg/m3、溫度25℃、流量10 L/(h·m2);將超濾液噴霧干燥成粉,相對生藥材的得率為0.9%[4]。
1.2.2 分組及細(xì)胞處理 將大鼠腎足細(xì)胞分為對照組、藥物組、TAX組和聯(lián)合組。TAX組一次性給予TAX 0.5μg/mL處理24 h,藥物組給予RAS-RH 10μg/mL培養(yǎng)24 h,聯(lián)合組先給予RAS-RH 10μg/mL培養(yǎng)24 h后再一次性給予TAX 0.5μg/mL處理24 h。
1.2.3 RTCA 檢測板前4孔加入150μL高糖培養(yǎng)基,后4孔加入150μL RAS-RH,放入RTCA Station中測定基線,保證每孔接觸正常且細(xì)胞指數(shù)在正常值內(nèi)。取制備好的大鼠腎足細(xì)胞懸液分別以每孔4×103個(gè)接種于E-Plate中,在超凈臺中靜置30 min后置于培養(yǎng)箱中的RTCA工作站中,每15分鐘記錄細(xì)胞指數(shù),總時(shí)長96 h。
1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 用0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞后預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞,在染色緩沖液中5×105/mL重懸細(xì)胞,吸取100μL細(xì)胞(1×105)至試管中,加入5μL熒光標(biāo)記的Annexin V(胞內(nèi)蛋白膜聯(lián)蛋白家族成員)和3μL碘化丙啶,混勻后避光室溫孵育15 min,孵育后加入400μL染色緩沖液,用流式細(xì)胞儀檢測。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以±s表示,采用單因素方差分析、t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 TAX對大鼠腎足細(xì)胞增殖的抑制作用 TAX組大鼠腎足細(xì)胞增殖受到明顯抑制,聯(lián)合組大鼠腎足細(xì)胞生長明顯優(yōu)于TAX組。見圖1。TAX對腎足細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長抑制作用,其抑制程度在一定時(shí)間內(nèi)(72 h)隨作用時(shí)間增加而增強(qiáng);聯(lián)合組大鼠腎足細(xì)胞生長優(yōu)于 TAX組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);TAX處理腎足細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)值為 4.700μg/mL,24 h后達(dá)到最大抑制率。見圖2。
圖1 各組大鼠腎足細(xì)胞生長情況比較(倒置相差顯微鏡,200×)
圖2 各組大鼠腎足細(xì)胞情況比較(RTCA實(shí)時(shí)分析)
2.2 RAS-RH對腎足細(xì)胞凋亡的影響 除藥物組大鼠腎足細(xì)胞凋亡率[(6.24±0.35)%]與對照組[(2.68±0.11)%]比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.093)外,TAX 組大鼠腎足細(xì)胞凋亡率[(20.59±3.74)%]均明顯高于對照組、藥物組、聯(lián)合組[(10.59±2.14)%],差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖 3。
圖3 各組大鼠腎足細(xì)胞凋亡率比較
《中國藥典》記載當(dāng)歸為傘形科植物[Angelica sinen?sis(Oliv.)Diels]的干燥根,具有“補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)止痛”等功效[5]。但陳曦等[6]利用陰離子SephadexG-100凝膠柱色譜分離純化當(dāng)歸多糖,得白色粉末狀多糖APS-bⅡ,采用四甲基偶氮唑鹽法觀察發(fā)現(xiàn),APS-bⅡ?qū)θ烁伟〩epG2、乳腺癌 MCF-7、宮頸癌 HeLa、結(jié)腸癌 SW1116細(xì)胞株均具有抑制其生長、增殖的作用。
紅芪為豆科巖黃芪(Hedysayum polybotrys hand?Mass)屬植物,《中國藥典》收載的常用中藥紅芪為多序黃芪的根基,紅芪入藥史載于南北朝梁-陶弘景著的《本草經(jīng)集注》,具有“扶正祛邪、益氣固本”的功效[5]。李世剛等[7]利用高效色譜得到均一性的紅芪多糖,結(jié)果發(fā)現(xiàn),紅芪多糖可明顯抑制人肝癌HepG2、胃癌MGC-803細(xì)胞增殖,使G0/G1期比例下降,G2/M期比例升高,增加其凋亡率,其機(jī)制可能是通過降低B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達(dá),升高半胱氨酸蛋白酶 3(Caspase-3)的表達(dá)有關(guān)。
本研究通過采用倒置相差顯微鏡法和RTCA觀察發(fā)現(xiàn),TAX對大鼠腎足細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用,RAS-RH對TAX導(dǎo)致的損傷具有一定的保護(hù)作用。
陳曦等[8]利用RNA干擾技術(shù)抑制了胃癌細(xì)胞SGC-7901 Bcl-2基因的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),Bcl-2小RNA分子可下調(diào)胃癌細(xì)胞SGC-7901 Bcl-2基因表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng) TAX的敏感性,合用TAX、Bcl-2小RNA具有顯著增強(qiáng)協(xié)同作用,比任何單獨(dú)用藥的細(xì)胞凋亡率高。王陽等[9]采用四甲基偶氮唑鹽法檢測了人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖活性,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn),芹黃素聯(lián)合TAX可協(xié)同抑制細(xì)胞增殖、遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用顯著增加。另外,TAX的作用機(jī)制獨(dú)特且復(fù)雜,現(xiàn)在普遍認(rèn)同的作用機(jī)制有以下幾個(gè)方面:如微管解聚穩(wěn)定機(jī)制[10]、免疫機(jī)制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞遷移等。其中可作用于細(xì)胞凋亡受體途徑的細(xì)胞凋亡膜表面分子通路[11]或激活半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。段永順[12]認(rèn)為,TAX可通過將腎癌細(xì)胞阻滯在G2/M期,從而起到抑制腎癌細(xì)胞增殖的作用。
朱貝貝等[13]通過原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞,采用X射線照射心肌細(xì)胞建立輻射損傷模型,采用不同濃度當(dāng)歸紅芪多糖進(jìn)行干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),輻射致心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一是線粒體凋亡通路的激活,而當(dāng)歸紅芪多糖可通過調(diào)控凋亡通路起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。由此作者聯(lián)想到,抗癌藥物TAX對腎足細(xì)胞損傷的作用是由于凋亡因子的表達(dá)下調(diào)機(jī)制,而當(dāng)歸紅芪多糖是否對TAX造成的大鼠腎足細(xì)胞損傷也會有類似的保護(hù)機(jī)制。為此本研究采用倒置相差顯微鏡觀察了大鼠腎足細(xì)胞增殖抑制過程,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TAX組大鼠腎足細(xì)胞生長、增殖明顯受到抑制,且細(xì)胞生長、增殖曲線與藥物濃度在一定時(shí)間內(nèi)呈依賴關(guān)系,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率為(20.59±3.74)%,RAS-RH聯(lián)合TAX可保護(hù)TAX造成的大鼠腎足細(xì)胞的損傷,聯(lián)合組細(xì)胞增殖數(shù)明顯高于TAX組,同時(shí),細(xì)胞增殖抑制曲線也高于藥物組,且TAX組大鼠腎足細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組、藥物組、聯(lián)合組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明RAS-RH可降低TAX誘導(dǎo)的大鼠腎足細(xì)胞凋亡。表明TAX可通過誘導(dǎo)大鼠腎足細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步激活凋亡通路造成腎足細(xì)胞的損傷;RAS-RH具有抑制細(xì)胞基因表達(dá),進(jìn)一步下調(diào)線粒體凋亡通路相關(guān)凋亡因子的產(chǎn)生而發(fā)揮腎足細(xì)胞保護(hù)作用。
綜上所述,RAS-RH對TAX誘導(dǎo)的大鼠腎足細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是RAS-RH通過下調(diào)大鼠腎足細(xì)胞凋亡率而實(shí)現(xiàn)的,但RAS-RH如何具體影響凋亡細(xì)胞的分子機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。
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