黎恒，張琳，陳紅爽，張孟陽(yáng)，黃娟，張嵐，王德培

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）是氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的乙?；苌铮巧锛?xì)胞內(nèi)許多重要多糖的基本組成單位，其在治療關(guān)節(jié)炎、抑制腫瘤和抗氧化等方面有明顯效果，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品以及食品行業(yè)[1-3]，市場(chǎng)需求巨大。目前生產(chǎn)NAG的方法主要是甲殼素酸水解法[4]和化學(xué)合成法[5]，但因環(huán)境污染巨大以及存在過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)等因素，安全環(huán)保且生產(chǎn)周期短的微生物發(fā)酵法開(kāi)始被關(guān)注和研究。而采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)NAG，關(guān)鍵在于菌株，目前國(guó)內(nèi)外研究方向主要是一些霉菌、大腸桿菌及芽孢桿菌，其發(fā)酵產(chǎn)量均不太理想[6-8]，因此通過(guò)分子改造或誘變選育來(lái)篩選高產(chǎn)菌株具有非常重要的意義。

等離子體誘變是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種物理誘變手段，由自由基、帶電粒子、中性粒子、光子等多種離子組成的等離子束作用于目標(biāo)菌株，具有高突變率和突變株遺傳穩(wěn)定性良好的特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于菌種誘變[9]。與分子手段相比，等離子體誘變育種具有操作簡(jiǎn)便、安全無(wú)毒、低成本的優(yōu)點(diǎn)[10]。多功能等離子體誘變 系 統(tǒng) （multifunction plasma mutagenesis system，MPMS）作為一種新一代微生物誘變平臺(tái)，以等離子體誘變?yōu)橹鳎膳c紫外、化學(xué)誘變等多種手段結(jié)合，又再次提高了突變率和突變類(lèi)型[11]。本試驗(yàn)首次采用等離子體-紫外復(fù)合誘變，對(duì)解淀粉芽孢桿菌BI2進(jìn)行誘變，通過(guò)對(duì)復(fù)合誘變條件的探究，以期來(lái)提高BI2產(chǎn)NAG的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌BI2（Bacillus amyloliquefaciens BI2）由天津科技大學(xué)生化過(guò)程與技術(shù)研究室自秸稈飼料中分離得到，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)：CGMCC No.3413。

1.1.2 試劑

無(wú)水葡萄糖、氯化鈉、（NH4）2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4（分析純）：博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂、甘油（分析純）：北京奧博星生物科技有限公司；谷氨酸鈉（純度≥99%）：天津市紅玫瑰食品有限公司；NAG標(biāo)品（純度≥99%）：美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂 1.5%；pH7.0～7.2；滅菌121℃，15min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉20 g/L，氯化鈉 5 g/L；pH 7.0～7.2；滅菌 115 ℃，20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 5 g/L，（NH4）2SO45 g/L，谷氨酸鈉 20 g/L，K2HPO4·3H2O 10 g/L，KH2PO45 g/L；pH7.5；滅菌 115 ℃，20 min。

葡萄糖篩選培養(yǎng)基：葡萄糖300g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母粉 0.5 g/L，氯化鈉 5 g/L，瓊脂 1.5%；pH 7.0～7.2；滅菌115℃，20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Mandela型多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS）：北京艾德豪克儀器生物有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；TU-1810紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；三層立式多功能搖床：上海旻泉儀器有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從斜面/平板挑取一環(huán)單菌落菌體接種到含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中250 r/min，34℃培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將活化好的種子液，以4%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中200 r/min，37℃發(fā)酵48 h。

誘變前菌體培養(yǎng)：取活化好的種子液，以4%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種到含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中250 r/min，34℃培養(yǎng)10 h，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期，鏡檢無(wú)芽孢。

1.3.2 菌株的誘變

菌懸液的制備：取1 mL誘變前菌體培養(yǎng)液12 000 r/min離心2 min，收集菌體，然后用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，最后將菌體重懸于無(wú)菌生理鹽水中，稀釋100倍，使細(xì)胞的終濃度為1×107個(gè)/mL。

等離子體誘變：取上述菌懸液10 μL均勻的涂布于誘變杯中，晾干后將其置于多功能等離子體誘變系統(tǒng)（multifunction plasma mutagenesis system，MPMS）中進(jìn)行等離子體誘變，以99%的氮?dú)庾鳛楣ぷ鳉怏w，輸入功率120 W，間距10 mm，氣流量10 L/min，分別誘變時(shí)長(zhǎng) 5、7、10、15、20、30、50 s來(lái)考察致死率及正突變率。

紫外誘變：取上述菌懸液10 μL均勻的涂布于誘變杯中，晾干后將其置于多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS）中進(jìn)行紫外誘變，紫外線(xiàn)燈管功率為20 W（提前預(yù)熱 20 min），處理距離 25 mm，處理時(shí)間 5、7、10、15、20、30、50 s來(lái)考察致死率及正突變率。

等離子體-紫外復(fù)合誘變：取上述菌懸液10 μL均勻的涂布于誘變杯中，晾干后將其置于多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS），先等離子體誘變處理一定時(shí)間，緊接著進(jìn)行紫外誘變?？疾熘滤缆始罢蛔兟?。

1.3.3 篩選方法

誘變初篩：在誘變處理后的誘變杯中加入1 mL生理鹽水將菌種洗下制成菌懸液。稀釋10倍后，取100 μL均勻涂到高糖篩選培養(yǎng)基表面，37℃靜置培養(yǎng)24 h，挑選菌落直徑≥3 mm的菌株。

誘變復(fù)篩：將保藏的初篩菌種接于液體種子培養(yǎng)基中，于搖床中250 r/min，34℃培養(yǎng)16 h，活化2次后以4%（體積比）的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖床中200 r/min，37℃培養(yǎng)48 h，采用高效液相色譜法分析乙酰氨糖產(chǎn)量，將高產(chǎn)菌株保存于20%（體積比）甘油管中-20℃保藏。

1.3.4 分析方法

致死率的計(jì)算：對(duì)誘變處理過(guò)的樣品在適當(dāng)?shù)南♂尪认峦堪錖B平板，通過(guò)菌落形成單位（colonyforming units，CFU）來(lái)計(jì)算其致死率，并獲得致死率曲線(xiàn)。

致死率/%=（對(duì)照板菌落數(shù)-誘變板菌落數(shù)）/對(duì)照板菌落數(shù)×100

正突變率的計(jì)算：挑取葡萄糖篩選平板上菌落直徑≥3 mm的菌株，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，以NAG產(chǎn)量較出發(fā)菌（BI2）提高20%的菌株統(tǒng)計(jì)為正突變株。

正突變率/%=正突變菌落數(shù)/葡萄糖篩選平板總菌數(shù)×100

NAG檢測(cè)方法：發(fā)酵液經(jīng)離心、稀釋后由Agilent 1200高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)[12]，色譜柱 HPX-87H（Bio-Rad），流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4，檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器，柱溫 60 ℃，流速 0.6 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩方法的建立

本試驗(yàn)所用菌株BI2在葡萄糖耐受試驗(yàn)中表現(xiàn)出高耐受性，在300 g/L葡萄糖濃度的平板培養(yǎng)下，依舊保持了30%的存活率，比較適合高糖高滲的工業(yè)化生產(chǎn)。且在高糖平板上其菌落直徑發(fā)生了較大改變，對(duì)菌落直徑大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表1所示。

表1 葡萄糖篩選平板菌落大小分布Table 1 The distribution of colony size on glucose screening plate

由表1可知，菌落直徑大小呈正態(tài)分布，菌落直徑≥3 mm的占10%，菌落直徑≤1.5 mm的菌落占20%，1.5 mm～3 mm的菌落占70%。對(duì)不同直徑菌落各取30個(gè)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證NAG產(chǎn)量，并與出發(fā)菌株對(duì)照，如表2所示。

表2 葡萄糖篩選平板菌落大小與NAG產(chǎn)量Table 2 NAG yeild with different colony sizes of strains on glucose screening plate

由表2可知，發(fā)現(xiàn)在高糖平板上菌落直徑大小與NAG產(chǎn)量呈正相關(guān)性，既菌落直徑越大其N(xiāo)AG產(chǎn)量越高，其在300 g/L葡萄糖高滲平板上長(zhǎng)勢(shì)越好，因?yàn)镹AG與芽孢菌細(xì)胞壁合成有關(guān)，NAG產(chǎn)量越高，芽孢菌細(xì)胞壁越完整[13]。因此，本試驗(yàn)選擇了葡萄糖篩選培養(yǎng)基并挑選菌落直徑≥3 mm的菌株，來(lái)作為初篩條件快速篩選NAG產(chǎn)量提高菌株。

2.2 等離子體誘變對(duì)菌株致死率及正突變率的影響

MPMS產(chǎn)生的等離子體中含有氮正離子（N+）、原子態(tài)氧（O）、OH-自由基等活性成分，可使微生物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并對(duì)DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子造成損傷，導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡。少量存活細(xì)胞通過(guò)修復(fù)機(jī)制，產(chǎn)生大量隨機(jī)突變[14]。因此，選擇合適的MPMS誘變時(shí)間能夠?qū)崿F(xiàn)微生物的快速誘變育種。

本試驗(yàn)先對(duì)出發(fā)菌株BI2進(jìn)行等離子體單獨(dú)誘變。測(cè)定其致死率曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 等離子體誘變對(duì)菌株致死率和正突變率的影響Fig.1 The effect of MPMS treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

由圖1可知，多功能等離子體誘變系統(tǒng)對(duì)BI2的致死力較強(qiáng)，MPMS處理20 s時(shí)致死率達(dá)到91%，處理50 s時(shí)致死率達(dá)到98%。有研究表明，當(dāng)微生物菌種的致死率為80%～95%時(shí)[15]，正突變率最高，但突變本身具有隨機(jī)性，其致死率與正突變率之間的關(guān)系并不是十分清楚，主要取決于誘變方法和菌株本身的特性。因此選取致死率在79%～96%之間的5個(gè)點(diǎn)測(cè)定其正突變率，如圖1顯示，結(jié)果表明等離子體處理15 s時(shí)正突變率最高，為15%，此時(shí)致死率為88%。

2.3 紫外誘變對(duì)菌株致死率及正突變率的影響

出發(fā)菌株經(jīng)紫外誘變處理不同時(shí)間的致死率和正突變率如圖2所示。

圖2 紫外誘變對(duì)菌株的致死率和正突變率影響Fig.2 The effect of Ultraviolet treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

由圖2可以看出，出發(fā)菌株對(duì)紫外處理也比較敏感，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸增加。當(dāng)處理10 s時(shí)，致死率為57%，當(dāng)處理30 s時(shí)，致死率為95%，處理50 s時(shí)致死率為100%。有文獻(xiàn)表明，紫外處理致死率在70%～80%之間時(shí)正突變率較高[16]。因此選取致死率在60%～95%之間的5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行正突變率測(cè)定。結(jié)果顯示，當(dāng)紫外線(xiàn)處理20 s時(shí)，正突變率最高為10%，此時(shí)致死率為84%。

2.4 等離子體-紫外復(fù)合誘變對(duì)菌株致死率和正突變率的影響

復(fù)合誘變包括兩種或多種誘變劑的先后使用、同時(shí)使用、同一誘變劑的重復(fù)使用。普遍認(rèn)為復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)。單一誘變因子長(zhǎng)期使用容易使菌株產(chǎn)生耐受性，兩種或兩種以上誘變劑合理搭配進(jìn)行復(fù)合誘變較單一誘變效果更好[17]。本試驗(yàn)采用先等離子體后紫外處理的復(fù)合誘變順序，主要考慮兩種方法的處理時(shí)間對(duì)菌株誘變效果的影響。依次選取兩種方法正突變率最高的3個(gè)水平設(shè)計(jì)了全面實(shí)驗(yàn)，探究復(fù)合誘變對(duì)菌株的致死率及正突變率影響。結(jié)果如表3所示。

由表3分析可知，在復(fù)合誘變中，隨著復(fù)合誘變時(shí)間的增加，致死率也隨之增加，但正突變率卻不一定隨之增加，說(shuō)明兩種誘變因子存在協(xié)同和交互作用。而當(dāng)致死率過(guò)高時(shí)，正突變率顯著下降。其中等離子體處理15 s，然后紫外處理15 s時(shí)正突變率最高為28%，此時(shí)致死率為92%。可以看到復(fù)合誘變較單因子誘變的正突變率提高明顯，較等離子體單獨(dú)處理提高1.86倍，較紫外單獨(dú)處理提高2.8倍。

表3 等離子體-紫外復(fù)合誘變對(duì)菌株的致死率和正突變率影響Table 3 The effect of MPMS-Ultraviolet treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

2.5 等離子體-紫外復(fù)合誘變的篩選結(jié)果

取等離子體處理15 s和紫外處理15 s的復(fù)合誘變后的菌懸液，按照1.3.3的方法進(jìn)行高濃度葡萄糖平板初篩，統(tǒng)計(jì)菌落直徑≥3 mm的占全部菌落的比例達(dá)到35%比出發(fā)10%有較大提高。由于在葡萄糖篩選平板上菌落大小與產(chǎn)NAG能力有正相關(guān)性，說(shuō)明經(jīng)復(fù)合誘變作用后，突變株的正突變率明顯提高，挑取40株按照1.3.3的方法進(jìn)行復(fù)篩，NAG產(chǎn)量見(jiàn)圖3所示。

由圖3可知，直徑≥3 mm的菌株中，80%的菌株發(fā)生了正突變，證明了初篩方法的有效性。從中篩選出一株NAG產(chǎn)量最高菌BH-7，NAG產(chǎn)量達(dá)到1.02 g/L，較出發(fā)菌提高3.4倍。經(jīng)過(guò)兩次復(fù)合誘變及篩選，分別篩選出 BH-14、BH-2-1、BH-3-2，NAG 產(chǎn)量依次為1.11、1.4、1.23 g/L，較出發(fā)菌分別提高 3.7、4.7、4.1 倍。

2.6 突變菌的遺傳穩(wěn)定性研究

為考察突變株的遺傳穩(wěn)定性，將經(jīng)過(guò)篩選到的四株產(chǎn)量提高菌（BH-7、BH-14、BH-2-1、BH-3-2）在 LB平板培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)10代，并將各代菌體分別經(jīng)種子活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定NAG產(chǎn)量，如圖4所示。

由圖4可知，菌株BH-7、BH-14、BH-2-1在傳代后NAG產(chǎn)量下降明顯，遺傳不穩(wěn)定。菌株BH-3-2在第3、4代產(chǎn)量略有下降，很快產(chǎn)量回復(fù)且遺傳比較穩(wěn)定。

圖3 復(fù)合誘變突變株NAG產(chǎn)量Fig.3 NAG production of the mutants on MPMS-Ultraviolet treatment

圖4 突變株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.4 Genetic stability experiment of the mutant strains

3 結(jié)論

本文研究了等離子體、紫外以及等離子體-紫外復(fù)合誘變對(duì)芽孢菌致死率及正突變率的影響，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析表明，等離子體誘變15 s時(shí)正突變率最高為15%，紫外誘變20 s時(shí)正突變率最高為10%，而在等離子體15 s和紫外15 s的復(fù)合誘變條件下，正突變率達(dá)到最高為28%，較單因子誘變效果提高明顯，可以作為誘變育種的首選方法。在該復(fù)合誘變條件下，通過(guò)初篩復(fù)篩，篩選出一株產(chǎn)量提高菌株BH-3-2。與出發(fā)菌株BI2相比，NAG產(chǎn)量從0.3 g/L提高到1.23 g/L，提高了4.1倍，傳代10次發(fā)現(xiàn)遺傳穩(wěn)定性良好。

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