張占林，喬勇升，王萍

（泰州市食品藥品檢驗所，江蘇泰州225300）

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是根據日本微生物學家Riichi Sakazakii名字命名[1]的一種革蘭陰性無芽孢桿菌，它寄生于人和動物腸道內，有周生鞭毛、能運動。2008年，Iversen等[2]根據擴增片段長度多態(tài)性、16S rRNA全序列、DNA-DNA雜交遺傳特征和Biotype100、Biologe細菌鑒定系統(tǒng)的表型特征等綜合分析，阪崎腸桿菌被重新分為腸桿菌科1個新屬，即克羅諾桿菌屬。阪崎腸桿菌能引起新生嬰幼兒菌血癥、小腸結腸炎和腦膜炎等嚴重疾病，在一些新生兒阪崎腸桿菌感染事件的調查中發(fā)現嬰幼兒配方奶粉為其主要感染源[3-4]，奶粉中3 CFU/100 g的阪崎腸桿菌污染就能導致感染的發(fā)生；此外，還可引起體弱者、孕婦和老年人局部感染和菌血癥等。而傳統(tǒng)檢測法中常有某些腸道細菌如變形桿菌因含有與阪崎腸桿菌相同的α-D-葡萄糖苷酶，或是奶粉中復雜的成分，影響了酶與底物的反應[5]，致使阪崎腸桿菌在顯色培養(yǎng)基上出現假陽性和假陰性的現象。因此，近年來阪崎腸桿菌的檢測給食品安全防治工作帶來嚴峻的挑戰(zhàn)[6-7]。

目前常用的阪崎腸桿菌檢測方法有生理生化鑒定法和分子生物學法[8-9]，基于FT-IR技術高分辨率、高指紋、快速、低成本等優(yōu)勢，我們用FT-IR技術對阪崎腸桿菌標準菌株、能力驗證樣品中分離得到的阪崎腸桿菌和干擾菌奇異變形桿菌進行了研究，從掃描得到的光譜信息中選取特征光譜區(qū)域，運用化學計量學方法分析各菌株間的異同，從而對它們進行更好的分類。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

標準菌株阪崎腸桿菌CGMCC1.6765：中國普通微生物菌種保藏管理中心；樣品阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌：江蘇泰州市食品藥品檢驗所微生物檢驗室參加NIFDC-PT-065能力驗證中分離保存且經過VITEK 2 Compact鑒定的菌株；營養(yǎng)肉湯和平板計數瓊脂：北京陸橋技術有限責任公司；氯化鈉（分析純）、溴化鉀（光譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

傅立葉變換紅外光譜儀（Thermo is10）：美國賽默飛世爾科技公司；冷凍臺式高速離心機（Allegra 64R）：美國貝克曼庫爾特公司；水浴恒溫振蕩器（SUA-C）：常州國華電器有限公司；真空恒溫干燥箱（VD23）：德國賓德公司；紫外-可見分光光度計（UV-2550PC）：日本島津公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9270）：上?；厶﹥x器制造有限公司。

1.3 操作方法

1.3.1 菌株復蘇及處理

從3株菌株保藏管中各挑取一環(huán)分別劃線接種于平板計數瓊脂平板上，36℃培養(yǎng)過夜，活化菌株。分別挑取已活化菌株的單菌落于裝10 mL營養(yǎng)肉湯試管中，置36℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，制成儲備培養(yǎng)物。各取一環(huán)試管中培養(yǎng)物分別接種于裝有100 mL營養(yǎng)肉湯三角瓶中，36℃，160 r/min震蕩培養(yǎng)18 h。取10 mL菌懸液并用適量營養(yǎng)肉湯稀釋，使3株菌的菌液濃度在 3.5×108CFU/mL～3.8×108CFU/mL 之間；此后將濃度一致的菌懸液進行離心沉淀，離心條件設置為20 ℃，8 000 r/min，5 min；棄去液體，收集菌體細胞，用0.9%的NaCl懸浮，同樣條件離心以達到洗滌效果；以同樣方式洗滌3次后，置于真空恒溫干燥箱中干燥。每個菌株進行8次相同試驗，每次設置3個平行重復。為了減少誤差，確保每次試驗的培養(yǎng)條件及細菌濃度盡可能統(tǒng)一。

1.3.2 菌體光譜信息采集

將干燥的菌體細胞研磨成均勻的菌粉，為減少微生物量的變化對譜圖的影響，以3∶100（質量比）加入溴化鉀，與菌粉混合研磨，利用壓片機制備薄片。將壓制好的均勻透明薄片置于傅立葉變換紅外光譜儀窗口采集光譜信息，采集條件設置為：自動扣除大氣背景，測量范圍為 4 000 cm-1～400 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描32次。

1.3.3 譜圖處理及分析

用OMNIC 9.0軟件先將各譜圖進行透光率與吸光度轉化，為了避免原始光譜基線偏離和由于樣品量不同而帶來的光譜數據偏差，先對光譜進行自動基線校正，縱坐標歸一化處理；再對歸一化后的譜圖進行比較篩選，剔除有較大偏離的異常譜圖，然后對篩好的光譜圖求平均光譜圖；最后將篩選出的光譜圖進行CSV數據格式轉化，以方便后續(xù)用PAST軟件對特定波數范圍內的光譜數據進行PCA和HCA分析。PAST軟件操作方法及原理詳見黃冰等[10]文獻報道。

2 結果與分析

2.1 譜圖結果分析

經過篩選，每株菌株建立了15張譜圖，其平均譜圖見圖1。

圖1中4 000 cm-1～400 cm-1波數范圍內的3株菌株平均光譜圖極為相似，無法用肉眼區(qū)分，這可能跟這3株菌株都是革蘭氏陰性腸桿菌，它們的結構組成本就相似以及親緣關系比較相近有關，故對其準確高效的分類還需借助計算機及化學計量學方法。據文獻報道[11-12]和本實驗室經驗[13]，光譜信息具有很強的指紋特征，能捕捉到細菌菌體間的細微差別，而這種差別與細菌的結構組成具有特定對應關系，在1 800 cm-1～900 cm-1光譜波數范圍內有3個特定吸收的“指紋區(qū)域”：酰胺區(qū)、混合區(qū)（包括脂肪酸、磷酸化合物和蛋白質）和多糖區(qū)。因此我們選擇1 800.224 cm-1～915.780 6 cm-1波數范圍內的光譜數據進一步做聚類分析。

圖1 3株菌株的平均FT-IR光譜Fig.1 Average FT-IR spectra of three strains

2.2 PCA分析

主成分是原始變量按一定權重線性組合之后而產生的保持原始數據的特征信息的新變量，代表每一類具有相似特征的變量所體現的綜合特點。主成分分析（principal component analysis）是一種基于投影技術的數據分析方法[14]，通過PCA分析投影計算處理后得到的第一個主成分PC1，代表原始數據的最大差異。除此，對仍有部分重要信息未被包含在PC1內的數據，沿著與PC1垂直方向尋得次級差異顯著的直線，經投影計算形成第二個主成分PC2。在此基礎上，PCA對空間的多維數據降維，最終直觀地展現出數據的分布散點圖，而使數據變得簡單易于理解。通過PCA分析不僅可對不同種群之間親緣關系進行判別，還可對不同屬種間的相似性進行研究比較[15]。將3株菌株的光譜數據經PCA分析，結果如圖2。

圖2 3株菌株的PCA聚類分析圖Fig.2 PCA cluster results of three strains

如圖2所示，橫坐標PC1的貢獻率為97.417%，縱坐標PC2的貢獻率為1.0366%，兩者貢獻率共達98.4536%，說明此聚類分析模型具有代表性。圖2中可見，3株菌株散點圖分布在縱軸左右兩個不同的區(qū)域，其中標準和樣品2株阪崎腸桿菌分在同一區(qū)域，但是它們卻分別單獨聚類；而奇異變形桿菌卻被單獨分在了另一個區(qū)域，這說明FT-IR技術結合PCA分析可以快速地對阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌進行分類和鑒定。

2.3 HCA分析

聚類分析（cluster analysis）是一種將研究對象進行多元統(tǒng)計分析，先聚類后再利用判別分析研究各個群體之間的異同，常用來衡量不同數據源間的相似性[15]。用離差平方和法（Ward，s method），歐氏距離（Euclidean）對3株菌株的光譜數據進行HCA分析，結果見圖3。

圖3 3株菌株的HCA聚類分析圖Fig.3 HCA cluster results of three strains

圖3中，同一菌株所有實驗數據歸為1簇，而不同菌株間實驗數據各自聚類且無交叉，共聚3簇。同時，標準與樣品2株阪崎腸桿菌聚在同一支上，且與奇異變形桿菌分屬不同的支類。由此可見，FT-IR技術結合HCA分析可以快速鑒定并區(qū)分阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌。不同來源的2株阪崎腸桿菌雖然被分在同一支，但是也分別單獨聚為一類，與PCA聚類分析一致。

3 討論與結論

在GB 4789系列食品安全國家標準中對一些食源性致病菌的分離檢測主要是靠一些分離培養(yǎng)基及一些顯色培養(yǎng)基加以分離培養(yǎng)，而在這些培養(yǎng)基上常常會出現一些與目標菌的形態(tài)特征極為相似的干擾菌，因此這就要求檢測人員用更多的時間和精力加以辨別區(qū)分。阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌在顯色培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)時雖然容易造成混淆，但是文中通過FT-IR技術，使阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌得到了很好地區(qū)分。不同來源的2株阪崎腸桿菌雖聚到了同一類，但卻分別單獨聚類而得到明顯區(qū)分，這可能是兩株阪崎腸桿菌雖是同一屬卻屬不同種所致，也有可能是來源、生長環(huán)境等其他一些外在的條件所致微生物菌體生化組成成分的稍許改變所致。同時，這也提示我們，為了得到更準確、更完整的光譜數據庫，我們在試驗過程中應確保每次試驗的培養(yǎng)條件、操作過程盡可能做到一致；此外，還應加大不同種的標準菌株信息采集，使光譜數據庫信息更全面，更穩(wěn)健，更具代表性和實用性。

FT-IR技術結合化學計量學方法建立了部分阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌的光譜數據庫，簡化了操作過程，縮短檢驗周期。PCA分析和HCA分析方法成功地將阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌進行各自聚類并加以區(qū)分，說明FT-IR技術對阪崎腸桿菌及奇異變形桿菌的分類鑒定提供了一種有效的工具，為其他食源性致病菌的分型研究提供了一種新的思路，也給食品質量安全檢測中微生物快速檢測的新方法開發(fā)提供一定參考。

參考文獻：

[1]FRMER III J J,ASBURY M A,HICKMAN F W,et al.The Enterobacteriaceae Study Group.Enterobacter sakazaki：a new species of“Enterobacteriaceae”isolated from clinical specimens[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,1980,30：569-584

[2]IVERSEN C,MULLANE N,MCCARDELL B,et al.Cronobactergen.nov.,a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii,and proposal of Cronobacter sakazakii gen.nov.,comb.nov.,Cronobacter malonaticus sp.nov.,Cronobacter turicensis sp.nov.,Cronobacter muytjensii sp.nov.,Cronobacter dublinensis sp.nov.,Cronobacter genomospedesI,and of three subspedes,Cronobacter dublinensis subsp.dublinensis subsp.nov.,Cronobacter dublinensis subsp.lausannensis subsp.nov.and Cronobacter dublinensis subsp.lactaridi subsp.nov.[J].Intemational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2008,58(6)：1442-1447

[3]IVERSEN C,FORSYTHE S.Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae from powdered infant formula milk and related products[J].Food Microbiology,2004,21：771-777

[4]徐灣,姜華,張選飛,等.我國克羅諾桿菌污染現狀與預防控制措施研究進展[J].中國病原生物學雜志,2015,10(9)：848-851

[5]盧勉飛,蔡芷荷,吳清平,等.阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基的應用研究[J].微生物學通報,2009,36(11)：1789-1793

[6]李艷娟,李朝旭,房新平,等.嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌污染防控及檢驗技術的研究進展[J].中國乳品工業(yè),2015,43(5)：38-42

[7]徐勵琴,羅澤燕,劉思超,等.2012～2014年惠州市市售食品中食源性致病菌污染狀況調查[J].實用預防醫(yī)學,2015,22(7)：812-815

[8]陳萬義,任婧,劉振民,等.嬰幼兒配方粉中克羅諾桿菌屬菌株檢測方法研究進展[J].乳業(yè)科學與技術,2015(2)：23-28

[9]李貞,楊保偉,夏效東,等.嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的研究進展[J].中國乳品工業(yè),2015,43(7)：35-41

[10]黃冰,DAVID A T HARPER,φYVIND HAMMER.定量古生物學軟件PAST及其常用功能[J].古生物學報,2013,52(2)：161-181

[11]DZIUBA B,BABUCHOWSKI A,NALECZ D,et al.Identification of lactic acid bacterica using FT-IR spectroscopy and cluster analysis[J].International Dairy Journal,2007,17(3)：183-189

[12]王靜,楊麗君,李兆杰,等.傅立葉變換紅外光譜技術對兩株大腸桿菌的鑒別[J].微生物學通報,2012,39(12)：1844-1850

[13]王萍,張占林,喬勇升.傅立葉變換紅外光譜技術對銅綠假單胞菌及其干擾菌的分類鑒定[J].食品科技,2017,42(4)：302-305

[14]阿基業(yè).代謝組學數據處理方法--主成分分析[J].中國臨床藥理學與治療學,2010,15(5)：481-489

[15]AL-QADIRI HM,LIN M,CAVINATO AG,et al.Fourier transform infrared spectroscopy,detection and identification of Escherichia coli O157:H7 and Alicyclobacillus strains in apple juice[J].International Journal of Food Microbiology,2006,111：73-80