張占林，喬勇升，王萍

（泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇泰州225300）

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是根據(jù)日本微生物學(xué)家Riichi Sakazakii名字命名[1]的一種革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，它寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)，有周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)。2008年，Iversen等[2]根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性、16S rRNA全序列、DNA-DNA雜交遺傳特征和Biotype100、Biologe細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的表型特征等綜合分析，阪崎腸桿菌被重新分為腸桿菌科1個(gè)新屬，即克羅諾桿菌屬。阪崎腸桿菌能引起新生嬰幼兒菌血癥、小腸結(jié)腸炎和腦膜炎等嚴(yán)重疾病，在一些新生兒阪崎腸桿菌感染事件的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)嬰幼兒配方奶粉為其主要感染源[3-4]，奶粉中3 CFU/100 g的阪崎腸桿菌污染就能導(dǎo)致感染的發(fā)生；此外，還可引起體弱者、孕婦和老年人局部感染和菌血癥等。而傳統(tǒng)檢測(cè)法中常有某些腸道細(xì)菌如變形桿菌因含有與阪崎腸桿菌相同的α-D-葡萄糖苷酶，或是奶粉中復(fù)雜的成分，影響了酶與底物的反應(yīng)[5]，致使阪崎腸桿菌在顯色培養(yǎng)基上出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的現(xiàn)象。因此，近年來(lái)阪崎腸桿菌的檢測(cè)給食品安全防治工作帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[6-7]。

目前常用的阪崎腸桿菌檢測(cè)方法有生理生化鑒定法和分子生物學(xué)法[8-9]，基于FT-IR技術(shù)高分辨率、高指紋、快速、低成本等優(yōu)勢(shì)，我們用FT-IR技術(shù)對(duì)阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、能力驗(yàn)證樣品中分離得到的阪崎腸桿菌和干擾菌奇異變形桿菌進(jìn)行了研究，從掃描得到的光譜信息中選取特征光譜區(qū)域，運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析各菌株間的異同，從而對(duì)它們進(jìn)行更好的分類。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

標(biāo)準(zhǔn)菌株阪崎腸桿菌CGMCC1.6765：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；樣品阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌：江蘇泰州市食品藥品檢驗(yàn)所微生物檢驗(yàn)室參加NIFDC-PT-065能力驗(yàn)證中分離保存且經(jīng)過VITEK 2 Compact鑒定的菌株；營(yíng)養(yǎng)肉湯和平板計(jì)數(shù)瓊脂：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（分析純）、溴化鉀（光譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

傅立葉變換紅外光譜儀（Thermo is10）：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)（Allegra 64R）：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；水浴恒溫振蕩器（SUA-C）：常州國(guó)華電器有限公司；真空恒溫干燥箱（VD23）：德國(guó)賓德公司；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-2550PC）：日本島津公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9270）：上?；厶﹥x器制造有限公司。

1.3 操作方法

1.3.1 菌株復(fù)蘇及處理

從3株菌株保藏管中各挑取一環(huán)分別劃線接種于平板計(jì)數(shù)瓊脂平板上，36℃培養(yǎng)過夜，活化菌株。分別挑取已活化菌株的單菌落于裝10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯試管中，置36℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，制成儲(chǔ)備培養(yǎng)物。各取一環(huán)試管中培養(yǎng)物分別接種于裝有100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯三角瓶中，36℃，160 r/min震蕩培養(yǎng)18 h。取10 mL菌懸液并用適量營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋，使3株菌的菌液濃度在 3.5×108CFU/mL～3.8×108CFU/mL 之間；此后將濃度一致的菌懸液進(jìn)行離心沉淀，離心條件設(shè)置為20 ℃，8 000 r/min，5 min；棄去液體，收集菌體細(xì)胞，用0.9%的NaCl懸浮，同樣條件離心以達(dá)到洗滌效果；以同樣方式洗滌3次后，置于真空恒溫干燥箱中干燥。每個(gè)菌株進(jìn)行8次相同試驗(yàn)，每次設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。為了減少誤差，確保每次試驗(yàn)的培養(yǎng)條件及細(xì)菌濃度盡可能統(tǒng)一。

1.3.2 菌體光譜信息采集

將干燥的菌體細(xì)胞研磨成均勻的菌粉，為減少微生物量的變化對(duì)譜圖的影響，以3∶100（質(zhì)量比）加入溴化鉀，與菌粉混合研磨，利用壓片機(jī)制備薄片。將壓制好的均勻透明薄片置于傅立葉變換紅外光譜儀窗口采集光譜信息，采集條件設(shè)置為：自動(dòng)扣除大氣背景，測(cè)量范圍為 4 000 cm-1～400 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描32次。

1.3.3 譜圖處理及分析

用OMNIC 9.0軟件先將各譜圖進(jìn)行透光率與吸光度轉(zhuǎn)化，為了避免原始光譜基線偏離和由于樣品量不同而帶來(lái)的光譜數(shù)據(jù)偏差，先對(duì)光譜進(jìn)行自動(dòng)基線校正，縱坐標(biāo)歸一化處理；再對(duì)歸一化后的譜圖進(jìn)行比較篩選，剔除有較大偏離的異常譜圖，然后對(duì)篩好的光譜圖求平均光譜圖；最后將篩選出的光譜圖進(jìn)行CSV數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)化，以方便后續(xù)用PAST軟件對(duì)特定波數(shù)范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和HCA分析。PAST軟件操作方法及原理詳見黃冰等[10]文獻(xiàn)報(bào)道。

2 結(jié)果與分析

2.1 譜圖結(jié)果分析

經(jīng)過篩選，每株菌株建立了15張譜圖，其平均譜圖見圖1。

圖1中4 000 cm-1～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的3株菌株平均光譜圖極為相似，無(wú)法用肉眼區(qū)分，這可能跟這3株菌株都是革蘭氏陰性腸桿菌，它們的結(jié)構(gòu)組成本就相似以及親緣關(guān)系比較相近有關(guān)，故對(duì)其準(zhǔn)確高效的分類還需借助計(jì)算機(jī)及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]和本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)[13]，光譜信息具有很強(qiáng)的指紋特征，能捕捉到細(xì)菌菌體間的細(xì)微差別，而這種差別與細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組成具有特定對(duì)應(yīng)關(guān)系，在1 800 cm-1～900 cm-1光譜波數(shù)范圍內(nèi)有3個(gè)特定吸收的“指紋區(qū)域”：酰胺區(qū)、混合區(qū)（包括脂肪酸、磷酸化合物和蛋白質(zhì)）和多糖區(qū)。因此我們選擇1 800.224 cm-1～915.780 6 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步做聚類分析。

圖1 3株菌株的平均FT-IR光譜Fig.1 Average FT-IR spectra of three strains

2.2 PCA分析

主成分是原始變量按一定權(quán)重線性組合之后而產(chǎn)生的保持原始數(shù)據(jù)的特征信息的新變量，代表每一類具有相似特征的變量所體現(xiàn)的綜合特點(diǎn)。主成分分析（principal component analysis）是一種基于投影技術(shù)的數(shù)據(jù)分析方法[14]，通過PCA分析投影計(jì)算處理后得到的第一個(gè)主成分PC1，代表原始數(shù)據(jù)的最大差異。除此，對(duì)仍有部分重要信息未被包含在PC1內(nèi)的數(shù)據(jù)，沿著與PC1垂直方向?qū)さ么渭?jí)差異顯著的直線，經(jīng)投影計(jì)算形成第二個(gè)主成分PC2。在此基礎(chǔ)上，PCA對(duì)空間的多維數(shù)據(jù)降維，最終直觀地展現(xiàn)出數(shù)據(jù)的分布散點(diǎn)圖，而使數(shù)據(jù)變得簡(jiǎn)單易于理解。通過PCA分析不僅可對(duì)不同種群之間親緣關(guān)系進(jìn)行判別，還可對(duì)不同屬種間的相似性進(jìn)行研究比較[15]。將3株菌株的光譜數(shù)據(jù)經(jīng)PCA分析，結(jié)果如圖2。

圖2 3株菌株的PCA聚類分析圖Fig.2 PCA cluster results of three strains

如圖2所示，橫坐標(biāo)PC1的貢獻(xiàn)率為97.417%，縱坐標(biāo)PC2的貢獻(xiàn)率為1.0366%，兩者貢獻(xiàn)率共達(dá)98.4536%，說明此聚類分析模型具有代表性。圖2中可見，3株菌株散點(diǎn)圖分布在縱軸左右兩個(gè)不同的區(qū)域，其中標(biāo)準(zhǔn)和樣品2株阪崎腸桿菌分在同一區(qū)域，但是它們卻分別單獨(dú)聚類；而奇異變形桿菌卻被單獨(dú)分在了另一個(gè)區(qū)域，這說明FT-IR技術(shù)結(jié)合PCA分析可以快速地對(duì)阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌進(jìn)行分類和鑒定。

2.3 HCA分析

聚類分析（cluster analysis）是一種將研究對(duì)象進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，先聚類后再利用判別分析研究各個(gè)群體之間的異同，常用來(lái)衡量不同數(shù)據(jù)源間的相似性[15]。用離差平方和法（Ward，s method），歐氏距離（Euclidean）對(duì)3株菌株的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA分析，結(jié)果見圖3。

圖3 3株菌株的HCA聚類分析圖Fig.3 HCA cluster results of three strains

圖3中，同一菌株所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)歸為1簇，而不同菌株間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)各自聚類且無(wú)交叉，共聚3簇。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)與樣品2株阪崎腸桿菌聚在同一支上，且與奇異變形桿菌分屬不同的支類。由此可見，F(xiàn)T-IR技術(shù)結(jié)合HCA分析可以快速鑒定并區(qū)分阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌。不同來(lái)源的2株阪崎腸桿菌雖然被分在同一支，但是也分別單獨(dú)聚為一類，與PCA聚類分析一致。

3 討論與結(jié)論

在GB 4789系列食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)一些食源性致病菌的分離檢測(cè)主要是靠一些分離培養(yǎng)基及一些顯色培養(yǎng)基加以分離培養(yǎng)，而在這些培養(yǎng)基上常常會(huì)出現(xiàn)一些與目標(biāo)菌的形態(tài)特征極為相似的干擾菌，因此這就要求檢測(cè)人員用更多的時(shí)間和精力加以辨別區(qū)分。阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌在顯色培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)時(shí)雖然容易造成混淆，但是文中通過FT-IR技術(shù)，使阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌得到了很好地區(qū)分。不同來(lái)源的2株阪崎腸桿菌雖聚到了同一類，但卻分別單獨(dú)聚類而得到明顯區(qū)分，這可能是兩株阪崎腸桿菌雖是同一屬卻屬不同種所致，也有可能是來(lái)源、生長(zhǎng)環(huán)境等其他一些外在的條件所致微生物菌體生化組成成分的稍許改變所致。同時(shí)，這也提示我們，為了得到更準(zhǔn)確、更完整的光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，我們?cè)谠囼?yàn)過程中應(yīng)確保每次試驗(yàn)的培養(yǎng)條件、操作過程盡可能做到一致；此外，還應(yīng)加大不同種的標(biāo)準(zhǔn)菌株信息采集，使光譜數(shù)據(jù)庫(kù)信息更全面，更穩(wěn)健，更具代表性和實(shí)用性。

FT-IR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立了部分阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌的光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，簡(jiǎn)化了操作過程，縮短檢驗(yàn)周期。PCA分析和HCA分析方法成功地將阪崎腸桿菌和奇異變形桿菌進(jìn)行各自聚類并加以區(qū)分，說明FT-IR技術(shù)對(duì)阪崎腸桿菌及奇異變形桿菌的分類鑒定提供了一種有效的工具，為其他食源性致病菌的分型研究提供了一種新的思路，也給食品質(zhì)量安全檢測(cè)中微生物快速檢測(cè)的新方法開發(fā)提供一定參考。

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