古麗娜孜·卡哈爾 努爾古麗·熱合曼 迪麗拜爾·玉山 麥克麗亞·亞力昆

(新疆師范大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830054)

新疆地域遼闊，氣候多樣，向來就以其豐富的乳制品資源著稱。當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)發(fā)酵酸奶更是歷史悠久，味道可口[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物區(qū)系通常有細(xì)菌與酵母菌組成，少數(shù)情況下也有霉菌參與。這些微生物在發(fā)酵過程中，增添了獨(dú)特的芳香物質(zhì)與層次感[2]。酵母菌在真核微生物群體當(dāng)中所占的數(shù)量龐大，分布廣泛，而且在生物技術(shù)方面擁有多種用途[3-4]。在眾多發(fā)酵食品當(dāng)中酵母菌占有舉足輕重的地位[5]。此外，酵母菌可以從外界環(huán)境中吸取酚類物質(zhì)，具有提高自身抗氧化活性的能力[6]，含有豐富的維他命B6、B12以及可以與各種酶類有協(xié)同作用的諸多礦物質(zhì)[7]。傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)的酸奶主要發(fā)酵菌是乳酸菌，很少會(huì)將酵母菌添加為發(fā)酵菌，酵母菌一直以來也被看做是引起產(chǎn)品腐壞的腐敗菌。

在鑒定方面，隨著科學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展，26S rDNA及其轉(zhuǎn)錄間區(qū) ITS 的序列分析等技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于酵母菌的分類與序列分析當(dāng)中[8-9]。Kurtzman等[10]對大約500種子囊菌酵母和擔(dān)子菌酵母26S rDNA 中的D1/D2區(qū)域序列進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該方法可以將絕大部分分離開來。由于這些序列均已公布于GenBank/EM-BL/DDBJ等國際核酸數(shù)據(jù)庫，為酵母菌的分子分類學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)和多樣性的研究帶來很大便利[11] 8-9。近年來，Lachance等[12]發(fā)現(xiàn)Clavisporalusitaniae的26S rDNAD1/D2區(qū)具有顯著的多態(tài)性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)愈來愈多的酵母菌中存在個(gè)體基因組ITS和26S rDNA序列多態(tài)性，同一菌株基因組內(nèi)不同類型的ITS序列差異也可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過菌種間的差異范圍[13]。因此，僅僅依靠單一序列的鑒定結(jié)果會(huì)有一定程度的不確定性。在抗氧化活性方面，中國已有利用抗氧化活性酵母在小鼠體內(nèi)進(jìn)行抗衰試驗(yàn)等方面的研究[14]。

本研究擬以新疆阿圖什與烏什的4種酸奶中分離純化得到的78株酵母菌為研究對象，采用26S rDNA D1/D2區(qū)域及ITS內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對其總抗氧化能力，羥基自由基抑制能力、抗超氧陰離子自由基能力以及脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)量進(jìn)行測定，篩選出具有優(yōu)良抗氧化活性的菌株；通過雙序列測序技術(shù)對分離得到的酵母菌進(jìn)行鑒定，使用MEGA 7.0等生物學(xué)軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并對南疆地區(qū)酸奶中的酵母菌抗氧化活性進(jìn)行初篩，為酵母菌資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及其來源

傳統(tǒng)手工酸奶：阿圖什與烏什地區(qū)農(nóng)民家庭作坊生產(chǎn)，將樣品裝置于無菌容器，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃保藏，從中分離純化得到78株酵母菌，標(biāo)號，并用20%甘油于-80 ℃超低溫冰箱保種。

1.1.2 儀器與試劑

立式壓力蒸汽滅菌器：LZDZX-30KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

離心機(jī)：BLF6型，上海一恒科技有限公司；

PCR儀：LNB48+型，上海皓莊儀器有限公司；

分光光度計(jì)：722型，上海菁華科技儀器有限公司；

酵母浸粉、蛋白胨：分析純，北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

葡萄糖、瓊脂：分析純，合肥志宏生物技術(shù)有限公司；

酵母菌基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；

上游引物(NL1、ITS1)、下游引物(NL4、ITS4)：上海生物工程股份有限公司；

總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(貨號A015-1)、脂質(zhì)過氧化(LPO)測試盒(貨號A106)、抗超氧陰離子自由基測試盒(貨號A052)、羥基自由基測定試劑盒(貨號A018)：南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

(1) 菌種活化：在提取酵母菌基因組DNA之前先對其進(jìn)行2次活化，將用甘油凍藏(-80 ℃)的酵母菌菌株按照1%的接種量接種于新鮮配置的YPD培養(yǎng)基中(10 g/L 酵母浸粉, 20 g/L蛋白胨，20 g/L 葡萄糖)[15]，28 ℃培養(yǎng)24 h。

(2) 總DNA的提取：DNA的提取按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，第二步略有改動(dòng)，水浴時(shí)間改為40 min對酵母菌進(jìn)行破壁處理[16]。

(3) 基因組DNA電泳：提取的DNA采用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓80 V，時(shí)長40 min，在凝膠成像儀中觀察凝膠。

(4) 26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增：酵母菌PCR擴(kuò)增體系見表1，引物為通用引物,正向引物NL1：(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)，反向引物NL4：(5’-GGTCCGTGTTTCA AGACGG-3’)。

表1 26S rDNA D1/D2區(qū) PCR擴(kuò)增體系[18]

擴(kuò)增循環(huán)為95 ℃ 5 min，預(yù)變性，94 ℃ 1 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min[17]。擴(kuò)增結(jié)束后取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Golden viewer核酸染料混合點(diǎn)樣，用(1×TAE)緩沖液制備2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增成功在600 bp左右形成可見條帶。PCR產(chǎn)物被送到新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

(5) ITS序列PCR擴(kuò)增：ITS PCR擴(kuò)增體系見表2，引物采用ITS通用擴(kuò)增引物，正向引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，反向引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。

表2 ITS PCR擴(kuò)增體系[18]16

擴(kuò)增循環(huán)為95 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min[18]15-16。擴(kuò)增結(jié)束后取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Golden viewer核酸染料混合點(diǎn)樣，用(1×TAE)緩沖液制備2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增成功在400～700 bp左右形成可見條帶[19]。PCR產(chǎn)物被送到新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

(6) 同源性分析：利用MEGA7.0 軟件，對被測酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)域、ITS序列以及GenBank中比對獲得的參比菌株序列進(jìn)行同源性分析，申請菌株登錄號，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.2 酵母菌抗氧化活性檢測

(1) 酵母菌細(xì)胞的收集：將-80 ℃下甘油保藏的菌株進(jìn)行活化，將活化好的酵母菌10 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞。

(2) 酵母細(xì)胞預(yù)處理：將離心收集的細(xì)胞用無菌水洗滌3～5次后進(jìn)行冷凍干燥(-48 ℃，4 Pa)，凍干細(xì)胞備用。利用反復(fù)凍融超聲破碎法[20]提取粗酶液。

(3) 抗氧化能力檢測：菌株總抗氧化能力(T-AOC)檢測[21]、羥基自由基抑制能力檢測、抗超氧陰離子自由基能力測試以及產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量測試均以南京建成測定試劑盒步驟進(jìn)行，每個(gè)樣品均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 26S rDNA序列分析結(jié)果

分別采用78株菌的基因組序列為模板，采用引物NL1、NL4擴(kuò)增出26S rDNA D1/D2序列，利用2.0%濃度的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，大小約為600 bp(圖1)。擴(kuò)增序列片段經(jīng)測序后，通過BIOEDIT生物軟件整理數(shù)據(jù)并在GenBank 中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，對同源性高的相似菌株序列進(jìn)行下載。結(jié)果表明，78株酵母菌的26S rDNAD1/D2區(qū)域基因序列同源性均≥99%，菌株登錄號及名稱見表3。

圖1 部分菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域序列電泳圖

隨后利用MEGA7.0對序列繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果表明，阿圖什與烏什縣傳統(tǒng)發(fā)酵乳當(dāng)中的酵母菌共屬于3個(gè)屬3個(gè)種，其中3個(gè)屬分別為酵母屬(Saccharomycescerevisiae)、克魯維酵母屬(Kluyveromycesmarxianus)、畢赤酵母屬(Pichiakudriavzevii)；3個(gè)種為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。

2.2 ITS序列分析結(jié)果

同樣采用78株酵母菌基因序列為模板，利用ITS1與ITS4引物對ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，將產(chǎn)物用濃度2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)在400～700 bp處出現(xiàn)條帶(圖3)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序后，通過BIOEDIT生物軟件整理數(shù)據(jù)并在GenBank 中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，對同源性高的相似菌株序列進(jìn)行下載。結(jié)果表明，78株酵母菌的ITS區(qū)域基因序列同源性均≥98%，與26S rDNA結(jié)果一致，菌株相似性比較結(jié)果見表4。

同樣利用MEGA7.0軟件繪制菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明，78株菌分屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。其中NG-98、NG-M66、NG-Y36 3株酵母菌ITS序列相似性只有98%，需通過TA克隆進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表3 菌株名稱及登錄號

2.3 抗氧化能力篩選

2.3.1 總抗氧化能力(T-AOC) 本試驗(yàn)通過總抗氧化能力試劑盒，最終測定出78株菌株中42株具有抗氧化活性，見圖5。

通過圖5可以看出，42株酵母中NG-Y50號菌抗氧化活性最高，為(107.33±2.97) U/mL；NG-L18號菌株抗氧化活性最低，僅為(4.29±2.84)U/mL。高于平均值的菌株有NG-40、NG-41、NG-54、NG-56、NG-57、NG-58、NG-87、NG-105、NG-L1、NG-Y50、NG-M60、NG-M66。

圖3 部分菌株ITS序列PCR產(chǎn)物電泳圖

分離菌株登錄號相似菌株分離菌株登錄號相似菌株NG-4KY888043Kluyveromyces marxianusNG-89KY888082Kluyveromyces marxianusNG-12KY888044Kluyveromyces marxianusNG-92KY888083Kluyveromyces marxianusNG-15KY888045Pichia kudriavzeviiNG-93KY888084Saccharomyces cerevisiaeNG-16KY888046Saccharomyces cerevisiaeNG-94KY888085Pichia kudriavzeviNG-21KY888047Saccharomyces cerevisiaeNG-95KY888086Kluyveromyces marxianusNG-30KY888048Kluyveromyces marxianusNG-97KY888087Saccharomyces cerevisiaeNG-31KY888049Kluyveromyces marxianusNG-98KY888088Pichia kudriavzeviiNG-33KY888050Saccharomyces cerevisiaeNG-99KY888089Kluyveromyces marxianusNG-36KY888051Kluyveromyces marxianusNG-100KY888090Kluyveromyces marxianusNG-38KY888052Kluyveromyces marxianusNG-101KY888091Kluyveromyces marxianusNG-39KY888053Kluyveromyces marxianusNG-102KY888092Saccharomyces cerevisiaeNG-40KY888054Kluyveromyces marxianusNG-103KY888093Saccharomyces cerevisiaeNG-41KY888055Kluyveromyces marxianusNG-104KY888094Kluyveromyces marxianusNG-42KY888056Kluyveromyces marxianusNG-105KY888095Saccharomyces cerevisiaeNG-43KY888057Kluyveromyces marxianusNG-106KY888096Kluyveromyces marxianusNG-44KY888058Kluyveromyces marxianusNG-136KY888097Kluyveromyces marxianusNG-45KY888059Kluyveromyces marxianusNG-L1KY888098Saccharomyces cerevisiaeNG-47KY888060Saccharomyces cerevisiaeNG-L8KY888099Saccharomyces cerevisiaeNG-48KY888061Kluyveromyces marxianusNG-L9KY888100Saccharomyces cerevisiaeNG-51KY888062Kluyveromyces marxianusNG-L13KY888101Saccharomyces cerevisiaeNG-53KY888063Kluyveromyces marxianusNG-L14KY888102Saccharomyces cerevisiaeNG-54KY888064Saccharomyces cerevisiaeNG-L17KY888103Saccharomyces cerevisiaeNG-56KY888065Kluyveromyces marxianusNG-L18KY888104Saccharomyces cerevisiaeNG-57KY888066Saccharomyces cerevisiaeNG-L27KY888105Saccharomyces cerevisiaeNG-58KY888067Kluyveromyces marxianusNG-L28KY888106Saccharomyces cerevisiaeNG-61KY888068Kluyveromyces marxianusNG-L29KY888107Saccharomyces cerevisiaeNG-69KY888069Kluyveromyces marxianusNG-M51KY888108Saccharomyces cerevisiaeNG-72KY888070Saccharomyces cerevisiaeNG-M60KY888109Saccharomyces cerevisiaeNG-78KY888071Kluyveromyces marxianusNG-M61KY888110Saccharomyces cerevisiaeNG-79KY888072Pichia kudriavzeviiNG-M66KY888111Saccharomyces cerevisiaeNG-80KY888073Kluyveromyces marxianusNG-Y31KY888112Saccharomyces cerevisiaeNG-81KY888074Saccharomyces cerevisiaeNG-Y33KY888113Saccharomyces cerevisiaeNG-82KY888075Kluyveromyces marxianusNG-Y34KY888114Saccharomyces cerevisiaeNG-83KY888076Kluyveromyces marxianusNG-Y35KY888115Saccharomyces cerevisiaeNG-84KY888077Kluyveromyces marxianusNG-Y36KY888116Saccharomyces cerevisiaeNG-85KY888078Saccharomyces cerevisiaeNG-Y38KY888117Saccharomyces cerevisiaeNG-86KY888079Kluyveromyces marxianusNG-Y39KY888118Saccharomyces cerevisiaeNG-87KY888080Kluyveromyces marxianusNG-Y45KY888119Saccharomyces cerevisiaeNG-88KY888081Saccharomyces cerevisiaeNG-Y50KY888120Saccharomyces cerevisiae

2.3.2 羥基自由基抑制能力 通過羥基自由基測定試劑盒對具有抗氧化活性的42株酵母菌進(jìn)行測定，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，在測試的這42株菌株中NG-M61號菌株抑制羥基自由基能力最高，為(755.80±3.63) U/mL；NG-M60號菌株抑制羥基自由基能力最低，僅為(60.46±4.66) U/mL。其中抑制羥自由基能力高于平均值的菌株有NG-15、NG-30、NG-33、NG-40、NG-41、NG-45、NG-53、NG-57、NG-58、NG-72、NG-84、NG-92、NG-93、NG-105、NG-106、NG-L1、NG-L13、NG-Y39、NG-Y50、NG-M51、NG-M61。對篩選抗氧化能力以及抑制羥基自由基能力均高于平均值的7株酵母菌進(jìn)行抗超氧陰離子自由基測定以及脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量測試。

圖4 部分菌株ITS序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖5 具有抗氧化活性的菌株及其抗氧化能力

圖6 42株酵母菌羥基自由基抑制能力

2.3.3 抗超氧陰離子自由基能力 抗超氧陰離子自由基能力見圖7。

由圖7可以看出，7株酵母菌中NG-105號菌株的抗超氧陰離子自由基能力最強(qiáng)[(134.29±1.72) U/mL]，NG-58號菌株最弱[(35.53±4.66) U/mL]。

2.3.4 脂質(zhì)過氧化物含量 脂質(zhì)過氧化物含量測定結(jié)果見圖8。

由圖8可知，本研究所測試的7株酵母菌，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物的含量偏低，脂質(zhì)過氧化物含量最高的菌株NG-Y57所產(chǎn)生的LPO值也僅為(4.97±0.11) μmol/L，而含量最低的菌株NG-105產(chǎn)生的LPO值只有(0.32±0.14) μmol/L。

由表5可以看出，NG-Y50號菌株抗氧化活性最高，抑制羥基自由基能力為(648.73±4.81) U/L，但是其抗超氧陰離子能力[(40.36±4.56) U/mL]不及NG-40，而且NG-40號菌株抗氧化活性為(106.41±3.92) U/mL，抑制羥基自由基能力為(651.24±3.75) U/L，抗超氧陰離子能力為(104.11±3.25) U/mL，而其所含有的脂質(zhì)過氧化物含量僅有(1.99±0.65) μmol/L。綜上所述，NG-40具有較強(qiáng)的抑制自由基能力，可被開發(fā)為新型抗氧化活劑。這株菌被鑒定為馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。

圖7 抗超氧陰離子自由基能力

3 結(jié)論

(1) 本研究對酸奶中的酵母菌進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明，38株屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，36株屬于馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，4株屬于畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。Gabriela Diosma等[22]對開菲爾樣品中分離出的酵母菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)它們屬于Saccharomycescerevisiae，Saccharomycesunisporus，Issatchenkiaoccidentalis，Kluyveromycesmarxianus4種酵母。但本試驗(yàn)的樣品中并沒有發(fā)現(xiàn)Saccharomycesunisporus以及Issatchenkiaoccidentalis等酵母菌種，這與樣品的地域性以及種類有關(guān)。 Yang等[23]以西藏牦牛酸奶為對象，對其中的酵母菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們同樣屬于釀酒酵母，馬克思克魯維酵母與畢赤酵母。李靜等[24]對新疆酸駝乳進(jìn)行研究時(shí)也同樣分離出這3種酵母。由此可見馬克思克魯維酵母與釀酒酵母在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中很常見。

圖8 菌株脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量測定

菌株號總抗氧化活性/(U?mL-1)抑制羥基自由基能力/(U?L-1)抗超氧陰離子自由基能力/(U?mL-1)脂質(zhì)過氧化物含量/(μmol?L-1)NG-40106.41±3.92651.24±3.75104.11±3.251.99±0.65NG-4157.41±0.98731.86±1.2795.00±1.873.20±0.80NG-5792.61±3.74628.57±4.9858.93±3.444.97±0.11NG-5880.19±2.57704.16±3.8835.53±4.661.49±0.56NG-10590.47±4.35561.78±4.65134.29±1.720.32±0.14NG-L137.57±4.09745.72±4.00117.14±4.631.84±0.91NG-Y50107.33±2.97648.73±4.8140.36±4.562.08±0.31

(2) 通過抗氧化活性試劑盒從78株酵母中篩選出7株高抗氧活性酵母，其中NG-40、NG-41、NG-58為馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，NG-57、NG-105、NG-L1、NG-Y50為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。戴玥等[25]通過超氧陰離子清除率等試驗(yàn)選出具有高抗氧能力的假絲酵母Y1，其羥基自由基清除能力超過40%。韋琰琰[26]從食品中篩選到1株具有高抗氧化活性的酵母菌Y11，并將其鑒定為Aureobasidiumpullulans。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致，說明酵母菌具有抑制和清除某些自由基的能力。在發(fā)酵食品中，釀酒酵母與馬克思克魯維酵母對食物風(fēng)味做出的貢獻(xiàn)較大[11]37-39[18]47-48，而畢赤酵母一般因其產(chǎn)氣效應(yīng)被視為污染菌[15]，本試驗(yàn)中篩選出抗氧化活性較高的7株酵母中也未發(fā)現(xiàn)畢赤酵母。

(3) 關(guān)于這78株酵母菌的生理生化特性以及對新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品風(fēng)味方面的作用有待進(jìn)一步研究。

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