張馨元 徐梁棕 汪少蕓

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108)

大豆分離蛋白(SPI)由于其均衡的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值已被廣泛應(yīng)用于食品加工工業(yè)中[1]。硒是一種人體必需的微量元素，具有抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)、預(yù)防癌癥、延緩衰老、提高機(jī)體免疫力、防止克山病以及大骨節(jié)病等多種生理功能[2]。由于人體無(wú)法自身合成硒元素，故對(duì)于缺硒人群，食物補(bǔ)硒非常重要，而亞硒酸鹽或硒酸鹽等無(wú)機(jī)硒因其毒性大、用量控制難無(wú)法直接添加至食品中，通常將其轉(zhuǎn)化為安全性高的有機(jī)硒。

目前已有堿性蛋白酶酶解的大豆多肽-硒螯合物的制備工藝及抗氧化性的研究[3]，但未對(duì)制備所得的肽-硒螯合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，也未對(duì)螯合物在油脂體系中的抗氧化活性進(jìn)行探究。本研究擬在蛋白酶的選擇及優(yōu)化方法上加以改進(jìn)，選擇能夠抑制苦味肽生成的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對(duì)SPI進(jìn)行酶解，改善酶解肽風(fēng)味，并對(duì)多肽螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，且進(jìn)一步對(duì)其在脂質(zhì)體系的過(guò)氧化能力進(jìn)行研究，挖掘其在脂質(zhì)體系的應(yīng)用潛力，旨在為有機(jī)硒補(bǔ)充劑的制備及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大豆分離蛋白：純度91.6%，福建圣農(nóng)食品有限公司；

復(fù)合風(fēng)味蛋白酶：2.0×105U/g，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；

3,3′-二氨基聯(lián)苯胺：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

亞硒酸鈉：分析純，成都西亞化工股份有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：AG264型，瑞士Mettler公司；

數(shù)顯PH計(jì)：FZ20型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

電熱水浴鍋：DK-S28型，上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司；

井式消化爐：KDN-16型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：752型，上海光譜儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-1C-50型，北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；

熒光光譜儀：970CRT型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白肽-硒螯合物制備工藝流程

大豆分離蛋白粉→稱(chēng)量→加蒸餾水→90 ℃水浴預(yù)熱→調(diào)節(jié)pH→加酶→一定溫度水浴酶解→滅酶(沸水，10 min)→離心(8 000 r/min，15 min)→取多肽上清液與亞硒酸鈉溶液混合→調(diào)節(jié)pH→水浴加熱→冷卻→離心(1 000 r/min，10 min)→取上清液→乙醇沉降(加9倍體積的無(wú)水乙醇)→離心(8 000 r/min，10min)→收集沉淀物→醇洗滌沉淀3次→去除沉淀物中酒精→復(fù)溶→凍干

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

(1) 水解度的測(cè)定：采用甲醛滴定法[4]。

(2) 硒含量和螯合力的測(cè)定：采用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺比色法[5]。

(3) 吸收光譜測(cè)定：配置50 μg/mL的大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白肽-硒螯合物溶液，取體積為3 mL的樣品溶液于石英比色皿中，將波長(zhǎng)設(shè)置為190～500 nm，進(jìn)行紫外光譜掃描。重復(fù)掃描3次。

(4) 熒光光譜測(cè)定：配置0.1 mg/mL的大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白肽-硒螯合物溶液，取3 mL置于比色皿中，進(jìn)行熒光光譜掃描。儀器的掃描條件是激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)的掃描范圍設(shè)置為300～500 nm，發(fā)射光與激發(fā)光縫寬均設(shè)為5 nm，靈敏度為3，采用高速掃描。

(5) 羥基自由基清除活力的測(cè)定：采用水楊酸法[6]。

(6) 還原力的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[7]。

(7) 金屬螯合活力的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[8]。

(8) 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性的測(cè)定：參照Osawa等[9]方法，修改如下：取濃度為1 000 μg/mL不同待測(cè)液1 mL于具塞比色管中，加入2 mL 95%乙醇、26 μL亞油酸及2 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L、pH 7.0)，充分混勻后，密閉放在暗處并保持40 ℃恒溫。空白組用1 mL蒸餾水代替樣品。每24 h測(cè)定一次體系過(guò)氧化程度。

1.3.3 大豆分離蛋白酶解條件優(yōu)化 選用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，在預(yù)試驗(yàn)(以螯合力為主要指標(biāo)，水解度為次要指標(biāo))基礎(chǔ)上，選取對(duì)螯合力影響較顯著的溫度、底物濃度及酶/底物3個(gè)因素，采用Box-Behnken進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表1。

1.3.4 大豆分離蛋白肽-硒螯合物制備工藝優(yōu)化 在預(yù)試驗(yàn)(以螯合力為指標(biāo))基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平及其編碼

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平及其編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 大豆分離蛋白酶解條件優(yōu)化 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。采用Design expert 8.0.6軟件對(duì)酶解響應(yīng)面設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。以螯合力為Y值，得出溫度、底物濃度和酶/底物的三元二次回歸方程：

Y=39.82-2.47A-3.21B+2.53C-0.072AB-0.86AC+0.48BC-17.20A2-14.81B2-9.96C2。

(1)

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表?

? *.差異顯著(P<0.05)；**.差異較顯著(P<0.01)；***.差異極顯著(P<0.001)。

優(yōu)化得到酶解的最優(yōu)工藝為：溫度49.62 ℃、底物濃度2.89%、酶/底物5.13 g/100 g，預(yù)測(cè)螯合力為40.25 mg/g。為方便試驗(yàn)操作調(diào)整螯合條件為溫度50 ℃、底物濃度3%、酶/底物5 g/100 g，對(duì)試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證得螯合力為(38.14±1.33) mg/g，且在此條件下制備所得多肽經(jīng)測(cè)定水解度為(23.57±2.17)%。

2.1.2 大豆分離蛋白肽-硒螯合物制備條件優(yōu)化 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。采用Design expert 8.0.6軟件對(duì)螯合物制備響應(yīng)面設(shè)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。以螯合力為Y值，得出溫度、時(shí)間和pH的三元二次回歸方程：

Y=46.69-2.47A-0.39B+8.21C+1.48AB-0.58AC-2.78BC-8.44A2-21.81B2-7.34C2。

(2)

優(yōu)化得到螯合的最優(yōu)工藝為：pH 10.58、時(shí)間1.97 h、溫度78.29 ℃，預(yù)測(cè)螯合力為49.27 mg/g。為方便試驗(yàn)操作調(diào)整螯合條件為pH 10、時(shí)間2 h、溫度78 ℃，對(duì)試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證得螯合力為(46.14 ±1.33) mg/g。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 吸收光譜 從圖1可以看出，SPIP和SPIP-Se的吸收光譜有顯著差異。SPIP的最強(qiáng)吸收峰在192 nm處，而SPIP-Se的最強(qiáng)吸收峰紅移至194 nm，且其峰強(qiáng)明顯增大，可能由于亞硒酸鈉溶液的加入，使多肽結(jié)構(gòu)中原本的生色團(tuán)和助色團(tuán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成電子躍遷，生成了新的大豆分離蛋白硒化多肽復(fù)合物。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表?

? *.差異顯著(P<0.05)；**.差異較顯著(P<0.01)；***.差異極顯著(P<0.001)。

2.2.2 熒光光譜 蛋白質(zhì)中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)均可發(fā)射熒光，且由于其側(cè)鏈生色基團(tuán)的不同而有不同的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。故氨基酸含量豐富的SPIP也具有一定熒光性，但由于其他元素與肽的結(jié)合，可導(dǎo)致熒光特性的變化，故可由熒光光譜推斷其結(jié)構(gòu)的變化。從圖2可以看出，SPIP和SPIP-Se的熒光強(qiáng)度和出峰位置都有明顯差異。SPIP-Se的熒光強(qiáng)度顯著變?nèi)?，說(shuō)明亞硒酸根與SPIP結(jié)合，導(dǎo)致熒光猝滅作用。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與金屬離子與蛋白肽反應(yīng)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[10]類(lèi)似。

圖1 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復(fù)合物的吸收光譜圖

圖2 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復(fù)合物的熒光光譜圖

2.3 抗氧化活性

2.3.1 羥基自由基清除活力 如圖3所示，SPIP和SPIP-Se均有一定的羥基自由基清除活力，且隨多肽濃度的增加，兩者的活力均有增強(qiáng)。在低蛋白濃度時(shí)，SPIP呈現(xiàn)比SPIP-Se更高的羥基自由基清除活力；但隨著蛋白濃度的增加至400 μg/mL 時(shí)，SPIP-Se的羥基自由基清除活力開(kāi)始顯著增高，當(dāng)?shù)鞍诐舛雀哂?00 μg/mL時(shí)，其羥基自由基清除活力始終高于SPIP，在濃度為1 000 μg/mL時(shí)，SPIP-Se的羥基自由基清除活力達(dá)61.42%。

圖3 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復(fù)合物的羥基自由基清除活性

2.3.2 還原力 如圖4所示，SPIP和SPIP-Se均有一定的還原力，且兩者還原力隨濃度的增加而增強(qiáng)。同一濃度時(shí)，SPIP-Se具有更強(qiáng)的還原力。

圖4 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復(fù)合物的還原力

2.3.3 金屬螯合活力 如圖5所示，SPIP和SPIP-Se均有一定的金屬螯合活力，且兩者金屬螯合活力隨濃度的增加而增強(qiáng)。與SPIP相比，SPIP-Se有非常強(qiáng)的金屬螯合活力，可能是由于肽鏈上接入了大量帶負(fù)電荷的亞硒酸基團(tuán)，靜電相互作用使其有很強(qiáng)的金屬螯合活力。

圖5 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復(fù)合物的金屬螯合活力

2.3.4 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性 亞油酸生成的過(guò)氧化物隨自氧化程度增加而增多，抗氧化劑的抗氧化力越弱，吸光值越高。如圖6所示，SPIP和SPIP-Se均對(duì)亞油酸自氧化有一定抑制作用，且SPIP-Se有較強(qiáng)的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性，可完全抑制亞油酸的自氧化反應(yīng)。

3 結(jié)論

以硒螯合力為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得出復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解SPI的最優(yōu)工藝和SPIP-Se的最優(yōu)制備工藝為：酶解溫度50 ℃、底物濃度3%、酶/底物5 g/100 g；螯合反應(yīng)pH 10、時(shí)間2 h、溫度78 ℃，所得SPIP-Se螯合物的硒含量為46.143 mg/g。采用吸收光譜和熒光光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，表明硒元素與SPIP有一定結(jié)合，并產(chǎn)生新的物質(zhì)，使SPIP原本的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。SPIP-Se有高于SPIP的羥基自由基清除活性、還原力、金屬螯合活力，且脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性試驗(yàn)表明濃度為1 000 μg/mL的SPIP-Se即可完全抑制亞油酸自氧化反應(yīng)，證明SPIP-Se在脂質(zhì)體系中有較強(qiáng)的抗氧化潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖6 大豆分離蛋白肽和大豆分離蛋白硒化多肽復(fù)合物的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性

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