李靜靜

(慶陽(yáng)市慶城縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 慶陽(yáng) 745100)

弓形蟲病是由剛第弓形蟲引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患原蟲病。該病在世界各地流行非常廣泛，在畜牧業(yè)行業(yè)中，弓形蟲的危害作用日益顯著，造成的經(jīng)濟(jì)損失日益增長(zhǎng)，對(duì)畜禽健康生長(zhǎng)造成較嚴(yán)重的制約。通常單一的感染不能引起明顯的臨床癥狀，但是一旦繼發(fā)感染，可造成嚴(yán)重后果，患病動(dòng)物死亡率會(huì)大大增加，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病的感染源主要是病畜和帶蟲動(dòng)物。貓及貓科動(dòng)物是弓形蟲的終末宿主。其中被終末宿主貓排出的卵囊污染的飼料、飲水或事具均可成為家畜感染的重要來(lái)源。畜禽和多種野生動(dòng)物對(duì)弓形蟲均具有感染性，其中包括 200多種哺乳動(dòng)物、70多種鳥類、5種變溫動(dòng)物和一些節(jié)肢動(dòng)物。一般以經(jīng)口感染為主，也可經(jīng)破損的皮膚和粘膜感染。家畜弓形蟲病一年四季均可發(fā)，但一般以夏秋季居多。

弓形蟲只有單一蟲種，但同一蟲株對(duì)不同宿主的敏感性、致病性差異較大，有滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊5種主要形態(tài)，需要兩個(gè)宿主，經(jīng)歷無(wú)性生殖和有性生殖兩個(gè)生殖過(guò)程。前兩種蟲體形態(tài)主要存在于中間宿主體內(nèi)，后三種蟲體主要出現(xiàn)在終末宿主體內(nèi)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 切片機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)、顯微鏡等。

1.1.2 主要試劑 10%福爾馬林溶液、75%酒精、80%酒精、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、 100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ、5%的酸化液、蘇木素染液、酸水分化、伊紅染液、中性樹膠等。

1.2 方法

1.2.1 切片操作 進(jìn)行石蠟的切片及HE染色，顯微鏡下觀察脾臟、肝臟、腎臟的病理學(xué)變化。

1.2.2 感染方法 病料人工經(jīng)口感染弓形蟲病的雞的脾臟、肝臟和腎臟。

2 石蠟切片，HE染色

2.1 石蠟切片

2.1.1 取材 用取材器輕輕地取脾臟、肝臟、腎臟的小塊組織為組織塊，不用力牽引，不再組織上來(lái)回拖拉，以免造成組織的結(jié)構(gòu)損傷。①樣品要求：長(zhǎng)，寬各1 cm左右，厚不得超過(guò)5 cm。②固定液：10%福爾馬林固定液：組織塊=20∶1。③固定時(shí)間：3～5 h，密封瓶口，封前換液。④修塊：順著組織方向，將切面修平，標(biāo)記，編號(hào)，用紗布包好，用于下步脫水固定。

2.1.2 脫水過(guò)程 ①水洗，將固定組織塊放入廣口瓶，瓶口用紗布包好，置流水下水洗，水洗時(shí)間為12 h 。②脫水，經(jīng)過(guò)固定后的組織塊沖洗后進(jìn)行脫水，脫水的目的是將組織內(nèi)的水分用酒精置換出來(lái)，使組織變硬，為熔化的石蠟浸滲到組織中創(chuàng)造條件。脫水的順序依次是：75%酒精 → 80%酒精→95%酒精Ⅰ→95%酒精Ⅱ→100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ。脫水時(shí)間為各1h。③透明，透明是切片前必經(jīng)之步。其目的在于用礦物油或植物油等透明劑置換出無(wú)水酒精，以便于熔化的石蠟浸滲到組織間隙內(nèi)。經(jīng)過(guò)透明劑處理的組織塊用肉眼觀察呈透明現(xiàn)象，因此將這個(gè)過(guò)程稱為透明。透明的順序依次是：酒精(100%)；二甲苯=1∶1 → 二甲苯Ⅰ→ 二甲苯Ⅱ→透明時(shí)間為各10 min。

2.1.4 浸蠟 浸蠟是將包埋組織用的物質(zhì)深入到所有的組織間隙中，然后將這種物質(zhì)凝固，從而將組織材料包埋其中的方法。浸蠟順序依次是：二甲苯∶石蠟=1∶1 →石蠟Ⅰ→石蠟Ⅱ→ 石蠟Ⅲ 。浸蠟的時(shí)間：二甲苯∶石蠟=1∶1為30 min，石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ的時(shí)間各1 h。浸蠟時(shí)溫箱的溫度應(yīng)保持在56～58℃。

2.1.5 包埋 包埋首先在金屬框架上涂抹凡士林，以保證石蠟倒入后不會(huì)外溢。將包埋用石蠟及浸蠟組織塊放在有石棉網(wǎng)的電爐上保溫。在框架中先倒入少許包埋用石蠟，再用鑷子將組織塊迅速移入框架，再倒入石蠟，待完全凝固后取出待用。

2.1.6 修蠟 取已包埋好的蠟塊，用解剖刀將組織塊周圍多余的石蠟切去，把有組織的蠟塊修成正方形或梯形，用于切片。

2.1.7 切片及展片 將修好的蠟塊固定于切片機(jī)上，調(diào)好距離和厚度，然后右手搖動(dòng)手柄切成5～8 μm薄片,切下的薄片用毛筆挑取放到加熱的水中展平，以便附貼。

2.1.8 附貼及烘片 將涂有附貼液(雞蛋清)的載玻片在展片池中撈取一展平的切片，放到烘片機(jī)上烘干，烘片機(jī)溫度應(yīng)保持在40～45℃之間，烘片時(shí)間為1 h。

2.2 染色

2.2.1 脫蠟 脫蠟的順序依次為 二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→ 100%酒精Ⅰ→ 100%酒精Ⅱ→ 95%酒精Ⅰ→ 95%酒精Ⅱ→ 80%酒精→自來(lái)水水洗。脫蠟的時(shí)間：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟各10 min，100%酒精Ⅰ脫二甲苯10 min，100%酒精Ⅱ、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、80%酒精脫二甲苯各5 min，自來(lái)水去酒精5 min。

2.2.2 染色 染色的順序依次為5%的酸化液 →蘇木素染液→沖洗→酸水分化→沖洗→伊紅染液。染色時(shí)間： 5%的酸化液為5 s，蘇木素染液為細(xì)胞核著色5 min，清水沖洗15 min，酸水分化液 (75%的酒精加500 mL的鹽酸就是0.5%的鹽酸酒精)10～20 s ，清水沖洗為淡藍(lán)色大概20 min即可，伊紅染液為細(xì)胞質(zhì)著色，一般為3 min。

2.2.3 脫水 脫水順序依次為 80%酒精→95%酒精Ⅰ→ 95%酒精Ⅱ → 100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ →二甲苯Ⅰ → 二甲苯Ⅱ 。 80%酒精顏色淡化5 min， 95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、100%酒精Ⅰ各5 min，100%酒精Ⅱ10 min ，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明時(shí)間分別為5 min、10 min。

2.2.4 封片及烤片 取一蓋玻片，輕輕以蓋玻片的一邊接近中間滴有中性樹膠的載玻片，然后迅速放下蓋玻片，中性樹膠會(huì)迅速擴(kuò)張到四周，校正好蓋玻片方向。將封好的切片放置在45℃烘片機(jī)上烘烤一夜。

3 結(jié)果

3.1 剖檢眼觀病理變化

脾臟稍腫并且有散在出血點(diǎn)。肝臟腫大，其表面散在粟粒大的出血點(diǎn)。腎臟蒼白，略腫，被膜下散在小出血點(diǎn)。

3.2 鏡檢結(jié)果

3.2.1 脾臟的病理學(xué)變化 脾臟充血出血(詳見圖1)，水腫，脾竇含血量增多，紅髓中可見壞死灶。被膜及小梁因平滑肌細(xì)胞水腫而略增厚，在有核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量弓形蟲滋養(yǎng)體，他們有的呈月芽狀或弓形，有的呈檸檬狀，圓形，橢圓形等多樣形狀。許多滋養(yǎng)體簇集在1個(gè)細(xì)胞內(nèi)形成假囊，在一視野里平均可找1個(gè)假囊(詳見圖2)。脾細(xì)胞大量壞死，有的已破裂崩解，滋養(yǎng)體從中逸出，有的細(xì)胞內(nèi)充滿了滋養(yǎng)體。細(xì)胞核已消失。此外脾組織內(nèi)充滿紅細(xì)胞，呈出血性壞死性炎癥。血液細(xì)胞內(nèi)的白細(xì)胞被滋養(yǎng)體破壞。

3.2.2 肝臟的病理學(xué)變化 肝細(xì)胞大量壞死，有的已破裂崩解，滋養(yǎng)體從中逸出，有的細(xì)胞內(nèi)充滿了滋養(yǎng)體。細(xì)胞核已消失。此外肝組織內(nèi)充滿了紅細(xì)胞，呈出血性壞死性炎癥，肝組織間隙內(nèi)有大量嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，血液細(xì)胞內(nèi)的白細(xì)胞被滋養(yǎng)體破壞。中央靜脈充血出血(詳見圖3)，肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性和空泡變性，間質(zhì)細(xì)胞增生(詳見圖4)。

3.2.3 腎臟的病理學(xué)變化 腎小球充血出血(詳見圖5)，水腫，腎小管漿液性滲出(詳見圖6)，在部分腎間質(zhì)有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，其間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生壞死。腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性和空泡變性(詳見圖7)。

圖3 肝臟中央靜脈充血出血。(HE，×400) 圖4 肝臟內(nèi)滋養(yǎng)體崩解。(HE，×400)

圖7 箭頭所指為腎小管上皮細(xì)胞充血，水腫，漿液滲出。(HE，×400)

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出雞人工經(jīng)口感染弓形蟲病病原體后，剖檢病變和組織學(xué)病理變化最明顯的皆是脾臟、肝臟、腎臟，病理變化發(fā)現(xiàn)其有嚴(yán)重的充血出血，水腫。鏡檢發(fā)現(xiàn)在有核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量弓形蟲滋養(yǎng)體，它們有的呈月芽狀或弓形，有的呈檸檬狀，圓形，橢圓形等多樣形狀。許多滋養(yǎng)體簇集在1個(gè)細(xì)胞內(nèi)形成假囊，在一視野里平均可找1個(gè)假囊。肝脾細(xì)胞大量壞死，有的已破裂崩解，滋養(yǎng)體從中逸出，有的細(xì)胞內(nèi)充滿了滋養(yǎng)體。細(xì)胞核已消失。此外肝臟、脾臟組織內(nèi)充滿紅細(xì)胞呈出血性壞死性炎癥血液細(xì)胞內(nèi)的白細(xì)胞被滋養(yǎng)體破壞。由此得出弓形蟲病對(duì)雞的養(yǎng)殖和人類健康存在很大的威脅，需引起人類重視。尤其在粗放型養(yǎng)雞場(chǎng)中，必須加強(qiáng)雞場(chǎng)的衛(wèi)生防護(hù)以保護(hù)養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展和人類健康。

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