李安，張翊，秦海，吳德智

（貴州理工學(xué)院貴陽(yáng) 550001）

0 引 言

黃精為百合科黃精屬植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，屬于藥食同源性中草藥。本品味甘性平，具有補(bǔ)中益氣、健脾潤(rùn)肺，益腎強(qiáng)骨的功效[1-2]。主要含有黃精多糖、皂苷、煙酸、醌類、氨基酸及微量元素等多種成分，具有延緩衰老、增強(qiáng)免疫功能、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤等多種藥理作用[2]。其中多糖是主要的活性成分，具有顯著的人體免疫活性、抗腫瘤作用、抗衰老、抗菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血糖血脂等作用[3]。根據(jù)其溶解性等特性，目前用于提取黃精多糖的提取分離方法包括熱水提取、醇析分離、微波輔助提取、超聲波提取等[4]。超聲波提取可以縮短提取時(shí)間，節(jié)省溶劑，提高有效成分的產(chǎn)率以及避免了高溫對(duì)有效成分的破壞等特點(diǎn)[5]。國(guó)內(nèi)外對(duì)黃精多糖在營(yíng)養(yǎng)保健、中老年疾病預(yù)防等方面的增值化產(chǎn)品已成為熱點(diǎn)，市場(chǎng)上已出現(xiàn)膠囊、顆粒、糖漿、茶、面膜等產(chǎn)品，但關(guān)于黃精多糖功能性飲料的研究還較為缺乏[6-9]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲提取黃精多糖，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化進(jìn)行工藝優(yōu)化以及調(diào)配型酸性功能乳飲料的配方研究，為進(jìn)一步挖掘黃精的利用，開(kāi)發(fā)黃精多糖類產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精：貴州產(chǎn)的多花黃精；無(wú)水碳酸鈉，葡萄糖，濃硫酸，苯酚等均為分析純；檸檬酸，白砂糖，脫脂乳粉：山東西唐生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GTSONIC-P20型超聲波清洗器：廣東固特超聲股份有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋：上海上天精密儀器有限公司；FA1004B電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海上天精密儀器有限公司；冷凍干燥儀：上海析域儀器設(shè)備有限公司；TDZS-WS型離心機(jī)：濟(jì)南福的機(jī)械有限公司；Sci?entz-150高壓均質(zhì)機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃精多糖提取及含量測(cè)定

黃精多糖的提取[10-11]：準(zhǔn)確稱取一定量黃精，40℃干燥后粉碎裝入三角燒瓶中，按實(shí)驗(yàn)要求在功率200W頻率40 kHz超聲條件下提取黃精多糖。浸提后以4 000 r/min冷凍高速離心15 min。取上清液于40℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，加80%乙醇靜置過(guò)夜，過(guò)濾后冷凍干燥得多糖粗提物。多糖粗提物用氯仿-正丁醇（4∶1）萃取多次，直至萃取液澄清，再往水相中加入95%乙醇使含醇量達(dá)80%，靜置過(guò)夜后過(guò)濾，所得固體依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干得精制黃精多糖。

多糖含量測(cè)定[12-13]：采用葡萄糖苯酚-硫酸分光光度法測(cè)定多糖含量。黃精多糖提取物，依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置30 min后，于487 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖為標(biāo)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出總酚含量Y與吸光度X的標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=0.0048X+0.0273，R=0.9993，在22.56-107.45 μg濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 單因素考察黃精多糖提取工藝

本實(shí)驗(yàn)分別考察液料比（5、10、15、20、25 mL·g-1）、超聲時(shí)間（5、20、35、50、65 min）、超聲溫度（30、40、50、60、70℃）3個(gè)因素，保持其中2個(gè)因素固定不變，研究另1個(gè)因素對(duì)黃精多糖提取率的影響，確定Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)所需的水平。

1.3.3 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化黃精多糖提取工藝[8]

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比(mL·g-1)、超聲時(shí)間（min）、超聲溫度（℃）3個(gè)對(duì)黃精多糖提取率影響較大的因素，采用Design-Expert8.0.6提供的Box-Behnken試驗(yàn)，以多糖提取率為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

1.3.4 黃精多糖調(diào)配型酸性功能乳飲料的制備

按實(shí)驗(yàn)要求稱取脫脂乳粉、黃精多糖、白砂糖，溶解于40℃去離子水中，置于磁力攪拌器上攪拌30 min，攪拌速度1000 r/min，而后均質(zhì)25 MPa。用檸檬酸調(diào)酸，加入0.6%復(fù)合穩(wěn)定劑（瓊脂∶CMC-Na∶黃原膠為1∶3∶2）進(jìn)行調(diào)配，在60℃、25 MPa下均質(zhì)1 h。均質(zhì)后110℃滅菌30 min，即得黃精調(diào)配型酸性功能乳飲料[14]。

1.3.5 單因素考察黃精多糖酸性功能乳飲料的配方

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)脫脂乳粉（10、15、20、25、30%）、黃精多糖（2、4、6、8、10%）、白砂糖（3、6、9、12、15%）以及檸檬酸（0、0.5、1、1.5、2%）添加量4個(gè)因素，保持其中3個(gè)變量固定不變，對(duì)另1個(gè)變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)10位具有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的評(píng)價(jià)員按表3對(duì)功能乳飲料進(jìn)行評(píng)分，以確定響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)配方的添加量范圍。

表1 黃精多糖提取的Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)指標(biāo)

表2 多酚功能飲料配方研究的混料設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.6 混料設(shè)計(jì)優(yōu)化多糖乳飲料的配方

以多糖乳飲料的感官評(píng)定的綜合評(píng)分為指標(biāo)，經(jīng)過(guò)配方的單因素實(shí)驗(yàn)，取脫脂乳粉、黃精多糖、白砂糖及檸檬酸4個(gè)對(duì)多糖乳飲料感官評(píng)分影響較大的因素，采用Design-Expert8.0.6提供的Box-Behnken試驗(yàn)，按照“1.3.4”項(xiàng)下方法制備多糖乳飲料，并測(cè)定感官評(píng)分，從而選出最佳配方。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2所示。

1.3.7 感官指標(biāo)

采用10名符合感官評(píng)定的人員（無(wú)特別口味偏好）進(jìn)行感官評(píng)定，采用百分制對(duì)功能乳飲料產(chǎn)品的組織形態(tài)（20分）、色澤（30分）、香氣（20分）、滋味（30分）等進(jìn)行感官評(píng)分。實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表3所示。

表3 多酚飲料的感官評(píng)定評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.8 理化指標(biāo)的測(cè)定方法

采用折光法測(cè)定可溶性固形物；用感官方法鑒定感官質(zhì)量；用酸度計(jì)測(cè)定pH值；用手持測(cè)糖儀測(cè)定總糖含量；微生物檢測(cè)：細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌，按食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)GB/T 4789.24-2003的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各提取因素對(duì)黃精多糖提取工藝的影響

2.1.1 液料比對(duì)多糖提取率的影響

由圖1（a）可知，隨著液料比的增加，多糖提取率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為15 mL·g-1時(shí)，多糖提取率最高為11.04±0.21%。主要是因?yàn)樘崛∫旱脑黾涌墒裹S精與提取溶劑充分接觸，有利于多糖的浸出，但提取液過(guò)多會(huì)增加了超聲波破碎細(xì)胞的阻力，使細(xì)胞破碎程度下降，從而降低了多糖的提取率；當(dāng)液料比小于15 mL·g-1時(shí)，多糖的提取基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此選定10-20 mL·g-1為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最佳水平。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖1（b）可知，隨著超聲時(shí)間的增加，多糖的提取率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為35 min時(shí)，多糖提取率已接近最大值為11.33±0.25%。這主要是因?yàn)槌晻r(shí)間的增加，黃精細(xì)胞破碎度增大，多糖溶出量逐漸增加，提取率提高；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)一步破碎，雜質(zhì)的溶出相應(yīng)增多，多糖的提取率下降，且長(zhǎng)時(shí)間超聲波的機(jī)械剪切使大分子的多糖斷裂，影響多糖的提取[15]。因此選擇超聲時(shí)間為20-50 min為考察的最佳時(shí)間。

圖1 不同提取因素對(duì)多糖提取率的影響

2.1.3 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖1（c）可知，隨著超聲溫度的增加，多糖提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為50℃時(shí)，多糖提取率已接近最大值11.72±0.18%。主要是由于低溫時(shí)超聲波未能使細(xì)胞徹底破碎，而隨著溫度的增加，分子的熱運(yùn)動(dòng)加速破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使多糖充分釋放；而溫度過(guò)高，高溫和超聲波破碎的協(xié)同作用導(dǎo)致部分多糖破壞和降解[16]。因此選擇最佳超聲溫度為40～60℃為響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)所需的水平范圍。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝的優(yōu)化

采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken試驗(yàn)，對(duì)各因素進(jìn)行擬合，得到多元回歸方程為：

R提取率=+10.430+0.920A+1.670B+0.230C+0.440AB-0.310AC-0.068BC-0.011A2-0.910B2-0.250C2

對(duì)多糖提取率的回歸模型進(jìn)行方差及顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。該模型方程有顯著性影響（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.1199＞0.05），說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映實(shí)驗(yàn)中各提取工藝參數(shù)對(duì)多糖提取率的影響。判定系數(shù)R2=0.9877，R2adj=0.9719，說(shuō)明回歸模型與實(shí)驗(yàn)值擬合均較好，可用于多糖提取率的理論推測(cè)和分析，各因素影響大小依次為：超聲時(shí)間＞液料比＞超聲溫度。由F檢驗(yàn)可知，液料比和超聲時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率有極顯著影響（p＜0.01），超聲溫度對(duì)黃精多糖提取率有顯著影響（p＜0.05）；在交互作用中，液料比與超聲時(shí)間之間的交互作用對(duì)黃精多糖提取率有極顯著影響(p＜0.01)，液料比與提取溫度之間的交互作用對(duì)黃精多糖提取率有顯著影響(p＜0.05)；在二次項(xiàng)中，提取時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率有極顯著影響(p＜0.01)；其他因素的影響不顯著(p＞0.05)。與圖2中3D效應(yīng)面圖反映出的各因素間的交互作用相吻合。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

圖2 各提取工藝參數(shù)之間的交互作用對(duì)黃精多糖提取率影響的3D效應(yīng)面圖

由Design-Expert8.0.6軟件得出香蕉皮多糖提取的最佳工藝參數(shù)是液料比19.65 mL·g-1、提取時(shí)間46.82 min、提取溫度49.48℃，多糖提取率為12.35%。為便于生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)需求，定為液料比20 mL·g-1、提取時(shí)間47 min、提取溫度50℃，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出的黃精多糖提取率為12.47±0.24%。該值與預(yù)測(cè)值比較近，因此選取此為黃精多糖的超聲提取工藝參數(shù)。

2.3 各因素對(duì)黃精多糖酸性功能乳飲料配方的影響

2.3.1 脫脂乳粉添加量對(duì)多糖乳飲料感官評(píng)分的影響

由圖3（a）可知，隨著脫脂乳粉添加量增大時(shí)黃精多糖酸性功能乳飲料的感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)脫脂乳粉添加量為15%時(shí)，感官評(píng)分最高為90.21±0.17。當(dāng)脫脂乳粉過(guò)少或過(guò)量，對(duì)乳飲料的組織狀、流動(dòng)性不利。因此響應(yīng)曲面的脫脂乳粉的水平范圍為10%～20%。

2.3.2 黃精多糖添加量對(duì)多糖乳飲料感官評(píng)分的影響

由圖3（b）可知，隨著黃精多糖的增加，多糖乳飲料的感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)多糖添加量為6%時(shí)感官評(píng)分最高為89.370.15。主要是因?yàn)辄S精多糖的增加使乳飲料的滋味發(fā)生改變，過(guò)多或過(guò)少時(shí)飲料酸甜不均，且黃精多糖的過(guò)多造成產(chǎn)品出現(xiàn)沉淀而影響感官評(píng)分。因此選擇4%～8%為黃精多糖添加量水平。

2.3.3 白砂糖添加量對(duì)多糖乳飲料感官評(píng)分的影響

由圖3（c）可知，隨著白砂糖的增加，多糖飲料的感官評(píng)分先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)白砂糖添加量為9%時(shí)，多糖飲料的評(píng)分最高為90.56±0.24，繼續(xù)提高白砂糖的含量導(dǎo)致飲料過(guò)甜不利于口感。因此選擇6%～12%為白砂糖的混料實(shí)驗(yàn)水平。

2.3.4 檸檬酸添加量對(duì)多糖乳飲料感官評(píng)分的影響

由圖3（d）可知，隨著檸檬酸添加量的增加，多糖乳飲料的感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)檸檬酸添加量為1%時(shí)，感官評(píng)分最高為88.86±0.11。檸檬酸的添加會(huì)影響乳飲料的酸甜影響口感。因此選擇0.5%～1.5%為檸檬酸添加量水平。

2.4 混料設(shè)計(jì)對(duì)多糖飲料配方的優(yōu)化

采用Design-Expert8.0.6提供的混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)各因素進(jìn)行擬合，得到多元回歸方程為：

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差及顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头匠田@著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.9934＞0.05），在本實(shí)驗(yàn)條件下，此回歸模型所考察的因素足以反映各成分對(duì)黃精酸性功能乳飲料感官評(píng)分的影響，判定系數(shù)R2=0.9813，R2adj=0.9626，說(shuō)明回歸模型與實(shí)驗(yàn)值擬合較好，可用于感官評(píng)分的理論推測(cè)和分析。各因素影響大小依次為：檸檬酸＞脫脂乳粉＞白砂糖＞黃精多糖。由F檢驗(yàn)可知，檸檬酸、脫脂乳粉和白砂糖對(duì)黃精多糖酸性乳飲料的感官評(píng)分具有極顯著影響（p＜0.01）；在交互作用中，脫脂乳粉與黃精多糖、黃精多糖與檸檬酸、白砂糖與檸檬酸添加量之間的交互作用對(duì)黃精多糖酸性乳飲料的感官評(píng)分具有極顯著影響(p＜0.01)，黃精多糖與白砂糖添加量之間的交互作用有顯著性影響(p＜0.05)；在二次項(xiàng)中，脫脂乳粉和黃精多糖添加量對(duì)黃精多糖酸性乳飲料的感官評(píng)分具有極顯著影響(p＜0.01)；其他因素的影響不顯著(p＞0.05)。與圖2中3D效應(yīng)面圖反映出的各因素間的交互作用相吻合。

圖3 不同配比對(duì)多糖酸性功能乳飲料感官評(píng)分的影響

圖4 多糖酸性功能乳飲料各組方的交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響的3D效應(yīng)面圖譜

由Design-Expert8.0.6軟件得出多糖復(fù)合飲料最優(yōu)配方為：脫脂乳粉24.65%、黃精多糖5.06%、白砂糖11.70%、檸檬酸1.48%，預(yù)測(cè)值為92.00。為便于生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)需求，定為脫脂乳粉25%、黃精多糖5%、白砂糖12%、檸檬酸1.5%、復(fù)合穩(wěn)定劑0.6%，選取該組合做進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得出的感官評(píng)分為92.36±0.17。與預(yù)測(cè)值相近，因此選取此組合為最優(yōu)黃精多糖酸性功能乳飲料。

2.5 優(yōu)化后產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.1 感官評(píng)價(jià)

色澤：呈淡黃色，色澤均一穩(wěn)定，有較好的光澤度，口感純正，酸甜適中，無(wú)異味，細(xì)膩，流動(dòng)性好，靜置無(wú)沉淀析出；滋味：有黃精氣味和牛奶香味。

2.5.2 理化指標(biāo)

滴定酸度：(96.24±0.31)°T；總糖：（9.31±0.27）g/100 g；pH值為3.2；可溶性固形物（20℃折光法）：6.03±0.06%；細(xì)菌總數(shù)≤100 CFU/mL；大腸菌群和致病菌未檢出。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行多糖提取工藝及酸性功能乳飲料的配方研究。結(jié)果表明：黃精多糖提取的最佳工藝條件為液料比20 mL·g-1、提取時(shí)間47 min、提取溫度50℃，黃精多糖提取率為12.47±0.24%；黃精多糖功能乳飲料配方為脫脂乳粉25%、黃精多糖5%、白砂糖12%、檸檬酸1.5%、復(fù)合穩(wěn)定劑0.6%，感官評(píng)分為92.36±0.17。多糖提取工藝穩(wěn)定可行，多糖調(diào)配型酸性功能乳飲料產(chǎn)品酸甜適中，營(yíng)養(yǎng)豐富，試驗(yàn)所得成品口感純正，穩(wěn)定性好，具有良好的工業(yè)生產(chǎn)加工前景。

表5 感觀評(píng)分回歸方程的方差與顯著性分析

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