田娜娜，郭子璇，王璐，李志成

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

0 引 言

抗菌肽抗菌活性測(cè)定方法有很多，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用擴(kuò)散法進(jìn)行抗菌肽活性的檢測(cè)[1-5]。擴(kuò)散法中的打孔法靈敏度高，抑菌圈規(guī)則清晰，效果好，但卻較為耗時(shí)[6]。生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中的菌種接觸到不同的抗菌肽等抑菌物質(zhì)，會(huì)形成大小不同的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小，則可以判斷出此種抑菌物質(zhì)的抗菌活性。同理，在菌懸液中加入不同濃度的抗菌肽等抑菌物質(zhì)，根據(jù)其吸光度的大小，可以判斷該物質(zhì)的抗菌活性。抑菌物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用成功地預(yù)防和治療了微生物引起的疾病的傳播，現(xiàn)正在以驚人的速度被添加到家庭的日用品和醫(yī)藥、保健品當(dāng)中[7-8]。抗菌肽作為一類(lèi)抑菌物質(zhì)，在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域和畜牧產(chǎn)業(yè)中成為了研究的熱點(diǎn)[9-12]。因此，如何快速而簡(jiǎn)便的測(cè)定抗菌肽等抑菌物質(zhì)的抗菌活性也就成為一個(gè)重要的問(wèn)題。

本文選取大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌三種常見(jiàn)的菌種，分別采用抑菌圈法和分光光度法對(duì)不同濃度的Nisin溶液進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，從而建立了上述兩種方法間的聯(lián)系，為快速而簡(jiǎn)便的檢測(cè)抗菌肽等抑菌物質(zhì)的抗菌活性提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌（Escherichia coliATCC25922）、沙門(mén)氏菌（SalmonellaLT2）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aures26111），西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保藏；牛肉膏、蛋白胨、營(yíng)養(yǎng)瓊脂為生化試劑；乳酸鏈球菌素（Nisin）、茶多酚和聚賴(lài)氨酸為食品級(jí)；鹽酸、無(wú)水乙醇、NaOH和NaCl為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，PB-10型數(shù)顯酸度計(jì)，SW-CJ-IF超凈工作臺(tái)，F(xiàn)1-45恒溫培養(yǎng)箱，SL502N高壓蒸汽滅菌鍋。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

參照蘇晉文的方法制作[13]。簡(jiǎn)述如下，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，加入5%的NaOH溶液，使其pH為7.4～7.6，于121℃高溫滅菌15 min，備用。固體培養(yǎng)基加入12 g瓊脂。

1.3.2 菌液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在無(wú)菌條件下，采用劃線法將甘油保藏的菌種于斜面培養(yǎng)基上連續(xù)活化2次。用接種針勾取活化后的新鮮菌落放入100 mL培養(yǎng)液中，搖勻混合液，放置在37℃下培養(yǎng)24 h，再用無(wú)菌培養(yǎng)液將其稀釋至107CFU/mL備用。通過(guò)測(cè)定大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌菌液吸光度和菌液濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]，如圖1所示。

圖1 菌液吸光度與其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 抑菌圈法與分光光度法檢測(cè)抑菌物質(zhì)的抗菌活性試驗(yàn)

用無(wú)菌水配制質(zhì)量濃度為0.20 g/L、0.40 g/L、0.60 g/L、0.80 g/L、1.00 g/L的Nisin溶液[14]，選取大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌種，采用抑菌圈法和分光光度法檢測(cè)Nisin溶液的抗菌活性，得出抑菌圈直徑比和抑菌率，建立抑菌圈法和分光光度法的關(guān)系。最后配制濃度梯度均為0.5 g/L、1.0 g/L和1.5 g/L的茶多酚溶液和聚賴(lài)氨酸溶液[14]，用相同的方法獲得其抑菌圈直徑比和抑菌率，建立抑菌圈法和分光光度法的關(guān)系。

1.3.3.1 抑菌圈法檢測(cè)Nisin溶液的抗菌活性試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，取107CFU/mL菌液100 μL，用玻璃刮板均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的表面，大約20 min后菌液被吸收，用外徑為8 mm的無(wú)菌小鋼管在瓊脂平板上打孔，每孔加入80 μL的Nisin溶液，水平置于4℃冰箱中，待Nisin溶液完全擴(kuò)散后（約2～3 h后），再移至37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。每組做3個(gè)平行，最后取平均值。以等量的0.85%（g/mL）生理鹽水作陰性對(duì)照組，以等量的0.64 mg/mL青霉素鈉作陽(yáng)性對(duì)照。當(dāng)樣品出現(xiàn)抑菌圈，以游標(biāo)卡尺量取其抑菌圈的直徑，直徑的大小代表其抑菌活性的大小[15]。

抑菌圈直徑比按照公式（1）計(jì)算：

1.3.3.2 分光光度法檢測(cè)Nisin溶液的抗菌活性試驗(yàn)

參考尹寧、潘曉倩[6,16]的方法，略作修改。分別取活化后菌液濃度為107CFU/mL的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌菌液10 mL，加到10 mL 0.20 g/L、0.40 g/L、0.60 g/L、0.80 g/L和1.00 g/L的Nisin溶液中。在陰性對(duì)照組中分別加入相應(yīng)體積的三種菌液和0.85%（g/mL）的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組中分別加入同樣體積的三種菌液和0.64 mg/mL的青霉素鈉溶液，均在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在600 nm處測(cè)定菌液的吸光度OD600，每組做3個(gè)平行，求平均值。

菌液培養(yǎng)前后吸光值的變化：

抑菌率按照公式（2）計(jì)算：

2 結(jié)果分析

2.1 Nisin溶液對(duì)不同菌種的抑菌效果

目前沒(méi)有采用抑菌圈法檢測(cè)抑菌物質(zhì)抗菌活性的國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，加在瓊脂孔內(nèi)或紙片上樣品量50～1000 μL不等[17-19]，瓊脂孔或紙片的直徑大小不一，5～15 mm均有[20-22]，這樣，僅用抑菌圈的直徑比較抑菌物質(zhì)的抗菌活性顯得不夠嚴(yán)謹(jǐn)。因此，提出用抑菌圈直徑比代替抑菌圈直徑表示抑菌圈法測(cè)定抑菌物質(zhì)的抗菌活性。

表1 Nisin對(duì)不同菌種抑菌圈直徑比的影響

本試驗(yàn)比較了不同質(zhì)量濃度Nisin對(duì)三種菌種抑制作用形成的抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比的大小。Nisin對(duì)不同菌種抑菌活性的影響見(jiàn)表1。由表1可知，對(duì)于大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，隨著Nisin溶液濃度的增加，抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比也逐漸增加。對(duì)于金黃色葡萄球菌，Nisin溶液濃度在0.20～0.60 g/L時(shí)，抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比隨著Nisin濃度的增加而增加，Nisin溶液濃度在0.60～1.00 g/L時(shí)，抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比的變化不大，這與李金春等研究Nisin對(duì)金黃色葡萄球菌的致死作用中的結(jié)果基本一致[23]，即Nisin的濃度范圍在0～0.4 g/L，隨著Nisin濃度的增加，對(duì)金黃色葡萄球菌的致死量顯著增加，Nisin濃度超過(guò)0.4 g/L，金黃色葡萄球菌致死量變化趨于平穩(wěn)。對(duì)于這三種菌種，Nisin對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最小，抑菌圈直徑和抑菌圈直徑比最小。

根據(jù)潘曉倩等的研究[6]，與本試驗(yàn)相比，加在瓊脂孔內(nèi)樣品量不等，瓊脂孔的直徑均為8 mm，形成的抑菌圈直徑不同，得出的抑菌圈直徑比也不同，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是所用Nisin溶液的活性不同。

2.2 不同菌種抑菌圈法和分光光度法的關(guān)系

2.2.1 大腸桿菌

圖2 Nisin的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（大腸桿菌）

由圖2可以看出，隨著抑菌率的增加，抑菌圈直徑比也按照一定比例增加。對(duì)于大腸桿菌，檢測(cè)不同濃度Nisin溶液抑菌效果的抑菌圈法和分光光度法之間存在指數(shù)關(guān)系，關(guān)系式為y=1.6329e0.0015x。分別檢測(cè)茶多酚溶液和聚賴(lài)氨酸溶液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果，見(jiàn)圖3。由圖3可知，茶多酚和聚賴(lài)氨酸對(duì)大腸桿菌的抑菌率和抑菌圈直徑比的關(guān)系均為二次多項(xiàng)式關(guān)系。根據(jù)以上關(guān)系式可以反推其抑菌圈直徑比和抑菌圈的直徑。例如當(dāng)Nisin、茶多酚和聚賴(lài)氨酸對(duì)大腸桿菌的抑菌率均為80%時(shí)，代入公式y(tǒng)=1.6329e0.0015x、y=0.0087x2-1.4783x+64.8和y=0.0003x2-0.0301x+2.5936中，可以得到抑菌圈直徑比分別為1.841、2.216和2.1056，若瓊脂孔或紙片的孔徑直徑為8 mm，那么可得出抑菌圈直徑分別為14.728 mm、17.728 mm和16.845 mm。

圖3 茶多酚和聚賴(lài)氨酸的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（大腸桿菌）

2.2.2 沙門(mén)氏菌

圖4 Nisin的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（沙門(mén)氏菌）

由圖4可知，Nisin對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌率在40%～70%的范圍內(nèi)增加時(shí)，其抑菌圈直徑比快速增大，此后抑菌圈直徑比隨抑菌率的增加而緩慢增加。對(duì)于沙門(mén)氏菌，加入不同濃度Nisin溶液，其抑菌圈法所得到的直徑比與分光光度法得到的抑菌率之間存在三次多項(xiàng)式的關(guān)系，關(guān)系式為y=0.000003x3-0.0007x2+0.0638x+0.0126。分別檢測(cè)茶多酚溶液和聚賴(lài)氨酸溶液對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果，見(jiàn)圖5。由圖4和圖5可知，隨著Nisin、茶多酚和聚賴(lài)氨酸對(duì)沙門(mén)氏菌抑菌率的增加，抑菌圈直徑比呈增加趨勢(shì)，存在多項(xiàng)式關(guān)系。當(dāng)Nisin、茶多酚和聚賴(lài)氨酸對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌率分別為70%、95%和50%，此時(shí)的抑菌率直徑比分別為2.0776、2.2559和1.8327。

圖5 茶多酚和聚賴(lài)氨酸的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（沙門(mén)氏菌）

2.2.3 金黃色葡萄球菌

圖6 Nisin的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（金黃色葡萄球菌）

由圖6知，抑菌圈直徑比隨著抑菌率的增加而增加。當(dāng)抑菌率小于40%，抑菌圈直徑比的增加緩慢；當(dāng)抑菌率大于40%，抑菌圈直徑比隨抑菌率的增加而上升較快。在不同濃度Nisin溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制試驗(yàn)中，抑菌圈直徑比與抑菌率之間存在二次多項(xiàng)式關(guān)系，關(guān)系式為y=0.00008x2-0.003x+1.0526。分別檢測(cè)茶多酚溶液和聚賴(lài)氨酸溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果，見(jiàn)圖7。由圖6和圖7可知，對(duì)于金黃色葡萄球菌，Nisin、茶多酚和聚賴(lài)氨酸對(duì)其抑制所形成的抑菌率和抑菌圈直徑比的關(guān)系分別為二次多項(xiàng)式、線性和二次多項(xiàng)式關(guān)系，并且隨著抑菌率的增加，抑菌圈直徑比呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。在錢(qián)麗紅[24]等的研究中測(cè)得2 g/L的茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為45.2%，代入茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率和抑菌圈直徑比的公式y(tǒng)=0.0101x+0.5189中，可得到抑菌圈直徑比為0.9754，進(jìn)而可得到不同孔徑下的抑菌圈直徑。

圖7 茶多酚和聚賴(lài)氨酸的抑菌率與其抑菌圈直徑比的關(guān)系（金黃色葡萄球菌）

因此，對(duì)于確定的菌種來(lái)說(shuō)，通過(guò)建立某抑菌物質(zhì)的抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系，可以用分光光度法快速而簡(jiǎn)便的測(cè)定某抑菌物質(zhì)的抗菌活性。

3 結(jié)論

不同濃度的Nisin溶液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌，其抑菌圈直徑比與其抑菌率之間分別存在指數(shù)、三次多項(xiàng)式和二次多項(xiàng)式關(guān)系。Nisin溶液對(duì)不同菌種抑菌效果的抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系不同，但對(duì)于同一菌種，Nisin溶液抑菌效果的抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系是確定的。經(jīng)驗(yàn)證，茶多酚和聚賴(lài)氨酸同樣適用以上規(guī)則。對(duì)于確定的菌種來(lái)說(shuō)，通過(guò)建立某抑菌物質(zhì)的抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系，就可以用分光光度法快速而簡(jiǎn)便的測(cè)定某抑菌物質(zhì)的抗菌活性。本文首次建立起抑菌圈法與分光光度法的聯(lián)系，提供了一種測(cè)定抑菌物質(zhì)抗菌活性的新思路，可以通過(guò)較為簡(jiǎn)單的操作得到更為直觀、可信的結(jié)果。

本試驗(yàn)主要對(duì)常見(jiàn)的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌以及金黃色葡萄球菌進(jìn)行驗(yàn)證，抑菌圈法與分光光度法之間的關(guān)系是否可應(yīng)用于其他菌種仍有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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