張媛，李鳳姿，王小壘，吳昊，楊洪巖

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150010）

0 引 言

亞硝酸鹽和硝酸鹽在食品中廣泛存在，其安全性問題為食品安全領(lǐng)域所關(guān)注[1]。亞硝酸鹽有發(fā)色、保持風(fēng)味、抗氧化和抑制革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)等特性，成為被廣泛使用的食品添加劑，然而過量添加則有亞硝酸鹽超標(biāo)導(dǎo)致不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]，大量攝入亞硝酸鹽會(huì)引發(fā)機(jī)體一系列的不良反應(yīng)，增加人體癌變幾率[4]。乳酸菌通常被認(rèn)為是安全的益生菌，其代謝產(chǎn)生酶、酸和其他物質(zhì)，是自然降解亞硝酸鹽的理想菌株[5]。

目前已經(jīng)報(bào)道的具有亞硝酸鹽降解能力的菌種包括：分離自西部發(fā)酵乳制品的瑞士乳酸菌（Lactoba?cillus helveticus）和植物乳桿菌（L.plantarum）；分離自木瓜中的乳糖乳球菌（Lactococcus lactis）[6]；分離自咸魚中戊糖乳球菌（Pediococcus pentosaceus）[7]；分離自傳統(tǒng)奶酪和發(fā)酵蔬菜的棒狀乳桿菌（L.coryniformis）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）和清酒乳桿菌（L.sakei）[8]；分離自水體中的發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）[9]；分離自漿水中玉米乳桿菌（L.zeae）[10]等。

本課題組前期從食品發(fā)酵體系中分離獲得L.plantarum、L.brevis、L.casei、L.paracasei、L.curvatus、Leu.cit?reum，最近我們又分離獲得了L.oligofermentans。初步研究結(jié)果表明，其具有很好的低溫環(huán)境下的亞硝酸鹽降解能力；為更全面地探究寡發(fā)酵乳桿菌的應(yīng)用潛力，本研究將購買的寡發(fā)酵乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AMKR18和植物乳桿菌（L.plantarum）作為對(duì)照，研究分離獲得的寡發(fā)酵乳桿菌SH-Y15的生長(zhǎng)特性及降解亞硝酸鹽能力，為其可能的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌株分離與鑒定

1.1.1 培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基配方如下[11]：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母5 g，無水乙酸鈉5 g，K2HPO42.62 g，檸檬酸二胺2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，H2O 1 000 mL，配制固體培養(yǎng)基時(shí)再加入瓊脂15 g。分離培養(yǎng)時(shí)用木糖代替葡萄糖，糖濃度仍然是2%（w/v）。

1.1.2 菌株的分離和純化

將自制發(fā)酵奶、發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵肉制品用平板稀釋法稀釋后30℃培養(yǎng)48 h，挑單菌落劃線純化，分別接于液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度為30℃。取培養(yǎng)良好的菌液750 μL與250 μL 80%甘油混合均勻[12]，保存在-70℃冰箱內(nèi)。

1.1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

菌株液體培養(yǎng)24 h后，取2 mL菌液，用細(xì)菌DNA提取試劑盒（Omega，USA）進(jìn)行DNA提取。用Nano Drop 1000(GE,USA)超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)所獲取的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，將DNA的濃度用Elution buf?fer稀釋至20～50 μg/μL以備PCR用。

PCR擴(kuò)增體系包括:10×buffer 5 μL，0.16 mmol/L dNTP 4 μL，1.5 mmol/L MgCl23 μL，上下游引物0.45 μmol/L各0.5 μ L，1 U的Takarar Taq DNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 35.8 μL。擴(kuò)增16S rDNA基因的引物對(duì)為27F(5'－AGAGTTT?GATCCTGGCTCAG－3')和1492R(5'－CGGT?TACCTTGTTACGACTT－3')[13]，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，隨后93℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3 min 50 s。

1.1.4 測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

將目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司純化后測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，利用BLAST網(wǎng)頁，與數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，從而最終確定目的基因的同源性。

通過MEGA 7.0軟件[14]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 菌株的生長(zhǎng)特性

1.2.1 菌株及主要材料來源

菌株AMKR18于日本菌株保藏中心購買，菌種保藏編號(hào)為JCM16175，菌株SH-Y15與LP分離自發(fā)酵食品，經(jīng)分離純化和16S rDNA測(cè)序鑒定后為L(zhǎng).oli?gofermentans和L.plantarum。

1.2.2 菌株的生長(zhǎng)特性

凍存菌種接種至MRS木糖培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)24 h作為生長(zhǎng)特性測(cè)定、耐性測(cè)定的接種劑，接種量為1‰。將菌株接種于MRS木糖培養(yǎng)基中，25℃下培養(yǎng)48 h，以波長(zhǎng)為600 nm處的OD值表示菌體生長(zhǎng)量（OD600），每隔4 h測(cè)定OD600。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 菌株耐性測(cè)定

將菌株接種于MRS木糖培養(yǎng)基中，分別在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃下培養(yǎng)48 h，測(cè)量OD600。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

將菌株分別接種于含鹽量（w/v)為0%、1%、2%、3%、4%、5%的MRS木糖培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)量OD600。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

將菌株分別接種于pH值為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2的MRS木糖培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)量OD600。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3 不同培養(yǎng)條件下SH-Y15降解亞硝酸鹽的影響

1.3.1 菌劑的制備

將三株乳酸菌分別接種于液體培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)24 h，5 800 r/min離心10 min去除培養(yǎng)基，懸于無菌生理鹽水中，再離心洗滌兩次后，重懸于無菌生理鹽水中，使其濃度為108CFU/mL。

1.3.2 菌株降解亞硝酸鹽能力測(cè)定

將菌株接種于含100 mg/L亞硝酸鈉MRS培養(yǎng)基（碳源分別為木糖和葡萄糖）中，接種量為105CFU/mL，在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和37℃下分別培養(yǎng)，每日測(cè)量亞硝酸鹽含量[15]。Control為不接菌對(duì)照。測(cè)量25℃下對(duì)應(yīng)發(fā)酵液的pH值和OD600。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。其測(cè)定數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；使用GraphPad Prism6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

本研究共分離獲得162株乳酸菌，將獲得的162株分離菌株的16S rDNA序列輸入到GenBank中，查詢與其同源性最高的菌種，所有序列與數(shù)據(jù)庫16S rDNA序列的同源性都高于99%。下載近緣種序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，分離到的162株菌分屬于Pediococcus pentosaceus、Weissella cibaria、Leuconostoc citre?um、Leu.mesenteroides、Leu.pseudomesenteroides、Lactococcus lactis、Lactobacillus sakei、L.plantarum、L.brevis、L.curvatus、L.coryniformis和L.oligofermentans，共12個(gè)菌種。本研究中所分離到的寡發(fā)酵乳桿菌命名為寡發(fā)酵乳桿菌SH-Y15。

2.2 菌株的生長(zhǎng)特性

將L.oligofermentansAMKR18、L.oligofermentansSH-Y15和L.plantarum（LP）為對(duì)照，將三株菌分別于培養(yǎng)基中25℃下進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)各菌株的生長(zhǎng)特性，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，在為期48 h的培養(yǎng)過程中，可以看到三株菌的生長(zhǎng)量不斷增加，在培養(yǎng)的前24 h增殖最為迅速。在24 h后，AMKR18與LP的OD值趨于平緩，而SH-Y15仍在顯著增長(zhǎng)，在48h結(jié)束時(shí)SH-Y15的OD值最高達(dá)到2.4，LP次之，AMKR18最低。

2.3 菌種耐性測(cè)定

將L.oligofermentansAMKR18、L.oligofermentansSH-Y15和L.plantarum（LP）三個(gè)菌株于不同溫度、pH及鹽濃度下培養(yǎng)，測(cè)定其對(duì)環(huán)境的耐受性，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，三株菌的生長(zhǎng)量都隨著溫度增加而增長(zhǎng)。在10℃時(shí)，SH-Y15生長(zhǎng)量遠(yuǎn)高于其他兩株菌（P＜0.01），說明其具有更好的低溫生長(zhǎng)能力。

整體上看三株菌的生長(zhǎng)量都隨著鹽濃度增加而減少；在鹽濃度為1%時(shí)，菌株生長(zhǎng)幾乎不受影響；當(dāng)鹽濃度增大到5%時(shí)，AMKR18和SH-Y15幾乎不生長(zhǎng)，LP仍可生長(zhǎng)。

圖1 代表菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析SH-Y*為本研究分離的代表菌株

當(dāng)pH值為3時(shí)，SH-Y15仍然有顯著生長(zhǎng)，說明其有明顯的增殖，耐酸性最強(qiáng)；其次為L(zhǎng)P，AMKR18的耐酸性最差。

圖2 菌株的生長(zhǎng)特性

2.4 亞硝酸鹽降解能力

2.4.1 五碳糖培養(yǎng)基質(zhì)中不同溫度培養(yǎng)對(duì)亞硝酸鹽降解的影響

將三株菌接入到含有亞硝酸鹽的MRS木糖培養(yǎng)基中，在不同溫度下培養(yǎng)6 d，測(cè)定其生長(zhǎng)過程中對(duì)于亞硝酸鹽的降解能力，結(jié)果如圖3所示。由圖可見，10℃培養(yǎng)時(shí)由于菌株增殖緩慢，僅SH-Y15表現(xiàn)出一定的亞硝酸鹽降解能力；在10～37℃之間，隨著溫度的上升，三株菌降解亞硝酸鹽的速度越來越快。10～25℃培養(yǎng)時(shí)對(duì)于亞硝酸鹽的降解主要發(fā)生在前4 d，三菌株中SH-Y15降解速度最快；在30℃和37℃培養(yǎng)條件下，降解主要發(fā)生于前2 d，SH-Y15與LP亞硝酸鹽降解趨同。

2.4.2 六碳糖培養(yǎng)基質(zhì)中不同溫度培養(yǎng)對(duì)亞硝酸鹽降解的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，L.oligofermentans經(jīng)過誘導(dǎo)后可以在葡萄糖等六碳糖培養(yǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)。本研究中所分離的SH-15經(jīng)過誘導(dǎo)后可以在六碳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，為了測(cè)試其在不同碳源培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽降解能力，將三個(gè)菌株接入到含有亞硝酸鹽的含葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中，在不同溫度下培養(yǎng)6 d，測(cè)定其生長(zhǎng)過程中對(duì)于亞硝酸鹽的降解能力，結(jié)果如圖4所示。由圖可見，在10～20℃之間，隨著溫度的增加，其亞硝酸鹽降解能力增強(qiáng)，三株菌相比較，SH-Y15顯示了更強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力。但在25～37℃時(shí)，隨著溫度的升高，LP降解亞硝酸鹽的能力超過SH-Y15。

2.4.3 優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)溫度下菌株的培養(yǎng)特性

SH-Y15在不同基質(zhì)培養(yǎng)基上其亞硝酸鹽降解能力不同，為研究產(chǎn)生這種結(jié)果可能的原因，在含有亞硝酸鹽的兩種碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)三株菌時(shí)，培養(yǎng)溫度為25℃，測(cè)量培養(yǎng)體系的pH值和OD600，結(jié)果如圖5所示。與圖2對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)體系添加亞硝酸鹽后，對(duì)于菌株的生長(zhǎng)未顯現(xiàn)出明顯的抑制作用。根據(jù)圖5所示，LP在兩種基質(zhì)中的pH值下降均最快。以木糖為碳源時(shí)，SH-Y15生長(zhǎng)速度最快（圖5a）；以葡萄糖為碳源時(shí)LP生長(zhǎng)速度最快（圖5b）。

表1 菌株耐性測(cè)定

圖3 木糖培養(yǎng)基上的亞硝酸鹽降解情況

圖4 葡萄糖培養(yǎng)基上的亞硝酸鹽降解情況

3 討 論

3.1 寡發(fā)酵乳桿菌的篩選及培養(yǎng)特性

在我們前期的研究中，通過克隆文庫的方法首次檢測(cè)到寡發(fā)酵乳桿菌[17]。根據(jù)Koort[18]和Andreevskaya[16]等人的研究，寡發(fā)酵乳桿菌能夠利用阿拉伯糖、核糖、木糖等五碳糖，對(duì)于六碳糖的利用是可以誘導(dǎo)的。在本研究中，我們采用阿拉伯糖、核糖和木糖對(duì)寡發(fā)酵乳桿菌進(jìn)行分離，在以木糖為碳源的培養(yǎng)基上獲得了SH-Y15。連續(xù)在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)2代后其可正常生長(zhǎng)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

寡發(fā)酵乳桿菌是一種嗜冷乳酸菌[18]，本研究中的SH-Y15菌株與分離于冷藏肉制品上的AMKR18相比，在培養(yǎng)過程中其表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐低溫性（表1）。在食品發(fā)酵過程中，由于植物乳桿菌較強(qiáng)的耐酸性而在發(fā)酵后期經(jīng)常被分離到[19-21]。本研究為檢測(cè)寡發(fā)酵乳桿菌的耐酸性，將SH-Y15、AMKR18和植物乳桿菌進(jìn)行了比較，結(jié)果表明SH-Y15耐酸效果顯著，在pH值為3時(shí)仍能生長(zhǎng)，顯示了其在低溫及酸性環(huán)境良好的生長(zhǎng)能力。

圖5 優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)溫度下不同碳源培養(yǎng)基菌株pH值及OD600

3.2 SH-Y15亞硝酸鹽降解能力

亞硝酸鹽為強(qiáng)氧化劑，其危害主要有兩點(diǎn)，一方面亞硝酸鹽能使血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白(Fe2+)氧化成高鐵（Fe3+）血紅蛋白，因而失去攜氧能力而引起組織缺氧[22]。另一方面在酸性環(huán)境中亞硝酸鹽與食物中的次級(jí)胺（仲胺、叔胺和酰胺）等反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺[23]，可誘發(fā)肝癌、食管癌、胃癌等多種癌癥[24]和疾病[25]。如何降低食品中的亞硝酸鹽含量是生產(chǎn)中需要解決的關(guān)鍵問題之一。對(duì)于乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解已有的研究多見于常溫下降解能力的研究[26-28]，對(duì)于相對(duì)低溫環(huán)境中亞硝酸鹽的降解研究不多見。本研究調(diào)查了菌株SH-Y15在生長(zhǎng)范圍內(nèi)的亞硝酸鹽降解特性，結(jié)果表明分別以木糖（五碳糖)和葡萄糖（六碳糖)作為碳源培養(yǎng)SH-Y15時(shí)，木糖培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽降解能力要高于葡萄糖培養(yǎng)基，這說明SH-Y15的亞硝酸鹽降解能力可能具有一定的基質(zhì)特異性。在葡萄糖培養(yǎng)基中的LP在25℃～37℃降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)于SH-Y15也從另一個(gè)角度說明這種基質(zhì)特異性的存在。很多冷藏食品及傳統(tǒng)食品中含有亞硝酸鹽，SH-Y15顯著的低溫降解亞硝酸鹽特性無疑為這些食品中亞硝酸鹽濃度的降低提供可能的解決方案。

[1]柳念,陳佩,高冰,等.乳酸菌降解亞硝酸鹽的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2017,38(7):290-295.

[2]曹雙弟,葛武鵬,楊靜,等.羊奶粉生產(chǎn)過程中化學(xué)性危害的分析與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)乳品工業(yè),2014,42(5):37-42.

[3]BA H V,SEO H W,CHO S H,et al.Antioxidant and anti-food?borne bacteria activities of shiitake by-product extract in fermented sausages[J].Food Control,2016,70:201-209.

[4]張翠芬.食品添加劑硝酸鹽、亞硝酸鹽檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑,2014,(6):152-155.

[5]吳敏,張?jiān)绿?曾凡駿,等.牛乳中亞硝酸鹽快速檢測(cè)試紙的研制[J].食品科技,2008,33(4):207-210.

[6]張利娟.木瓜上降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及其應(yīng)用[D].海南大學(xué),2014.

[7]劉法佳,吳燕燕,李來好,等.降解咸魚中亞硝酸鹽的乳酸菌降解特性研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,39(1):94-97.

[8]FANG F,FENG T,DU G,et al.Evaluation of the impact on food safety of a Lactobacillus coryniformis strain from pickled vegetables with degradation activity against nitrite and other undesirable com?pounds[J].Food Additives&Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure&Risk Assessment,2016,33(4):623.

[9]韓梅,王衍強(qiáng),彭帥,等.降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離與鑒定[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,42(2):216-219.

[10]吳慧昊,牛鋒,陳珊珊,等.高效降亞硝酸鹽乳酸菌的馴化復(fù)篩及菌株鑒定[J].食品科學(xué),2016,37(19):160-165.

[11]COTTER P D,HILL C,ROSS R P.Bacteriocins:developing in?nate immunity for food[J].Nature Reviews Microbiology,2005,3(10):777-788.

[12]AMANN R I,LUDWIG W,SCHLEIFER K H.Phylogenetic iden?tification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiological Reviews,1995,59(1):143.

[13]YANG H,WU H,WANG X,et al.Selection and characteristics of a switchgrass-colonizing microbial community to produce extracellular cellulases and xylanases[J].Bioresource Technol,2011,102(3):3546-3550.

[14]KUMAR S,STECHER G,TAMURA K.MEGA7:Molecular Evo?lutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets[J].Molec?ular Biology&Evolution,2016,33(7):1870.

[15]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 5009.33-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[16]ANDREEVSKAYA M,JOHANSSON P,J SKEL INEN E,et al.Lactobacillus oligofermentans glucose,ribose and xylose transcrip?tomes show higher similarity between glucose and xylose catabo?lism-induced responses in the early exponential growth phase[J].Bmc Genomics,2016,17(1):539.

[17]YANG H,ZOU H,QU C,et al.Dominant Microorganisms during the Spontaneous Fermentation of Suan Cai,a Chinese Fermented Vegetable[J].Food Science&Technology Research,2014,20(5):915-926.

[18]KOORT J,MURROS A,COENYE T,et al.Lactobacillus oligofer?mentans sp.nov.,associated with spoilage of modified-atmo?sphere-packaged poultry products[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(8):4400-4406.

[19]張魯冀,孟祥晨.自然發(fā)酵東北酸菜中乳桿菌的分離與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(11):125-131.

[20]李超,張力群,劉通,等.東北酸菜傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中的真核微生物多樣性[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(9):52-58.

[21]楊洪巖,李超,劉通,等.傳統(tǒng)東北酸菜發(fā)酵過程中的細(xì)菌動(dòng)態(tài)及多樣性[J].食品工業(yè)科技,2015,36(1):154-159.

[22]GREER F M.Infant methemoglobinemia:the role of dietary nitrate in food and water[J].Pediatrics,2005,116(3):784-786.

[23]SANTAMARIA P.Nitrate in vegetables:toxicity,content,intake and EC regulation[J].Journal of the Science of Food&Agriculture,2006,86(1):10-17.

[24]BRYAN N S,ALEXANDER D D,COUGHLIN J R,et al.Ingest?ed nitrate and nitrite and stomach cancer risk:an updated review[J].Food&Chemical Toxicology,2012,50(10):3646-3665.

[25]SUN Y C,MI J C,LEE S J,et al.-nitrosamine inhibition by straw?berry,garlic,kale,and the effects of nitrite-scavenging and-nitrosa?mine formation by functional compounds in strawberry and garlic[J].Food Control,2007,18(5):485-491.

[26]張慶芳,遲乃玉,鄭燕,等.乳酸菌降解亞硝酸鹽機(jī)理的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(8):27-31.

[27]黃丹,劉有晴,于華,等.四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉中乳酸菌的分離及發(fā)酵特性研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(3):149-152.

[28]PAIK H D,LEE J Y.Investigation of reduction and tolerance capabil?ity of lactic acid bacteria isolated from kimchi against nitrate and ni?trite in fermented sausage condition[J].Meat Science,2014,97(4):609-614.