鐘智，孫天松，陳永福

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

0 引 言

Streptococcus thermophilus(S.thermophilus)是一種重要的工業(yè)菌株，它常與Lactobacillus bulgaricus復配用于酸奶發(fā)酵，可以顯著改善乳制品的風味、口感和組織狀態(tài)[1]。除了對乳制品的快速酸化，發(fā)酵劑菌株還需要具有增加發(fā)酵乳黏度和持水性等特性。而這些特性均與菌株產(chǎn)胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）能力顯著相關[2-3]。因此，菌株產(chǎn)EPS的能力是篩選S.ther?mophilus酸奶發(fā)酵劑的一項重要指標。

Streptococcus thermophilusND-07（ND-07）是分離自青海地區(qū)自然發(fā)酵酸牦牛奶樣品中的一株S.ther?mophilus[4]。研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有弱后酸化、高黏度和高持水性的優(yōu)良發(fā)酵特性，具有成為一株優(yōu)良的商業(yè)化發(fā)酵菌株的潛在能力。為了全面了解菌株ND-07的發(fā)酵特性，深入分析ND-07產(chǎn)EPS的分子機制，本研究利用PacBio RS II三代測序技術完成了ND-07的全基因組測序，并通過比較基因組學方法闡明了ND-07富產(chǎn)EPS的分子機制。

1 實驗

1.1 實驗菌種

菌株ND-07分離自青海地區(qū)自然發(fā)酵酸牦牛奶樣品，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。菌株S.thermophilusYX-S（YX-S）分離自商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11（Chr Hansen,Denmark）。

1.2 菌株發(fā)酵特性的研究

1.2.1 發(fā)酵酸乳樣品的制備

將全脂復原乳（蔗糖6.5%、全脂粉11.5%）預熱至60℃，高壓均質（一段20 MPa，二段4 MPa），95℃殺菌10 min，冷卻至42℃并接入5×106cfu/g已制備好的ND-07和YX-S的發(fā)酵劑，于42℃培養(yǎng)至pH值為4.5，將其置于冰水中迅速冷卻。冷卻后置于4℃后熟12 h[5]。

1.2.2 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵乳樣品從發(fā)酵開始到發(fā)酵乳pH值下降至4.5所需的時間為發(fā)酵時間。

1.2.3 滴定酸度的測定

取發(fā)酵乳樣品5.0 g，加入40 mL蒸餾水，混合均勻，加入5滴0.5%酚酞指示劑，用標準0.1 mol/L NaOH滴定至淡粉色，1 min不消失為宜。滴定酸度（吉爾涅爾度°T）為100 mL發(fā)酵乳消耗0.1 mol/L NaOH的毫升數(shù)[5]。

1.2.4 黏度的測定

將發(fā)酵乳樣品調至室溫，用Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度儀(Brookfield Engineering Labora?tories，Inc，Middleboro，MA)4#轉子對其進行測定，轉子轉速100 rpm，扭矩20～100%，測定時間30 s[5]。

1.2.5 脫水收縮性的測定

稱取20.0 g發(fā)酵乳樣品，置于帶有濾紙的漏斗中，4℃放置120 min，收集濾液并稱重。脫水收縮性(%)=(濾液重g/樣品重量g)×100%[5]。

1.3 Streptococcus thermophilus ND-07的全基因組測序

1.3.1 菌株DNA提取

將菌株在脫脂乳培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)10 h,以2%接種量接種于M17培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)三代，將第三代M17液體培養(yǎng)液離心（3 000 g/min，10 min）并收集菌體。收集的菌體采用OMEGA-D3392基因組DNA提取試劑盒提取樣品中基因組DNA，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因組測序

采用PacBio SMRT測序流程對提取的基因組DNA建立10-kb文庫，建庫后采用PacBio RS II測序平臺進行全基因組測序。

1.3.3 生物信息學分析

基因組組裝采用Hierarchical Genome Assembly Process(HGAP)workflow(PacBioDevNet;Pacific Bio?sciences)[6]。利用Glimmer 3.02[7]對組裝后的基因組序列進行CDS預測。tRNA和rRNA分別采用tRNAscan-SE 1.23[8]和RNAmmer 1.2[9]進行預測。預測的CDS用nr數(shù)據(jù)庫，COG[10]和RAST[11]進行功能基因預測。

1.4 NCBI收錄號

ND-07基因組數(shù)據(jù)和注釋結果已經(jīng)上傳到了NCBI的Genbenk數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），收錄號為：CP016394。

2 結果與分析

2.1 Streptococcus thermophilus ND-07的發(fā)酵特性

本研究對ND-07和YX-S的發(fā)酵乳樣品從發(fā)酵開始到發(fā)酵乳pH值下降至4.5所需的發(fā)酵時間，發(fā)酵終點和4℃后熟12 h后的滴定酸度、黏度和脫水收縮性等發(fā)酵特性進行了分別測定，所有發(fā)酵特性的測定均采用5個生物學重復。

如表1所示，菌株ND-07的滴定酸度和脫水收縮性等發(fā)酵特性與商業(yè)化菌株YX-S相比無顯著差異。在發(fā)酵時間方面，ND-07的發(fā)酵時間為8.30±0.78，比YX-S的發(fā)酵時間稍長。在黏度方面，ND-07在發(fā)酵終點的黏度為1249±188.17 cp，顯著高于YX-S在發(fā)酵終點的黏度，而在4℃后熟12 h后，ND-07和YX-S的黏度無顯著差異。我們知道產(chǎn)黏特性好的菌株可以減少發(fā)酵乳的乳清析出，提高組織狀態(tài)[12]。因此，產(chǎn)黏特性是商業(yè)化菌株的一個重要的評價指標。黏度主要受發(fā)酵菌株所產(chǎn)EPS影響，黏度較高表明ND-07具有富產(chǎn)EPS的能力。

表1 菌株ND-07和YX-S的發(fā)酵乳發(fā)酵特性

綜合分析發(fā)現(xiàn)，菌株ND-07的發(fā)酵特性與商業(yè)化菌株YX-S相比，在滴定酸度和脫水收縮性等方面無顯著差異，ND-07的發(fā)酵時間稍長，發(fā)酵終點的黏度甚至要高于YX-S，表明ND-07具有進一步開發(fā)成為商業(yè)化發(fā)酵菌株的巨大潛力。

2.2 Streptococcus thermophilus ND-07的基因組基本特征

為了全面了解菌株ND-07的發(fā)酵特性，深入分析ND-07產(chǎn)EPS的分子機制，本研究利用Pacbio RS II第三代測序平臺對ND-07進行了全基因組測序。ND-07基因組為環(huán)狀(見圖1)?；蚪M全長為1 869 510-bp，GC含量為39.0%。共編碼2 095基因，包含1 959個功能基因、15個rRNA、57個tRNAs和64個假基因(見表2)。

圖1 ND-07基因組圖譜

表2 ND-07基因組基本信息

利用COG對編碼基因進行功能分類后發(fā)現(xiàn)有991個基因具有明確的生物學功能，占全部編碼基因的50.6%（見圖2）。其中與氨基酸轉運和代謝（Amino acid transport and metabolism）相關的功能基因最多，達到了173個，占全部編碼基因的11.3%。其次為與復制、重組和修復（Replication,recombination and repair）相關的基因，為167個。排在第三位的是與翻譯以及核糖體結構和生物起源（Translation,ribosomal struc?ture and biogenesis）相關的基因，為141個。這三類功能基因占全部編碼基因的24.6%。此外，基因組中還包含有64個參與碳水化合物轉運和代謝相關的基因，主要參與乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖和海藻糖等重要的低聚糖的轉運和代謝。

圖2 ND-07基因組基因COG功能分類

2.3 Streptococcus thermophilus ND-07中的胞外多糖基因簇

通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn)ND-07基因組中含有一個20.5-kb的EPS基因簇，其中包括19個與產(chǎn)EPS相關的基因（ND-07_1743 to ND-07_1762）（見圖3）。在基因簇5'端是deoD基因，它是一個嘌呤核苷磷酸化酶，主要參與核苷酸的生物合成和分解代謝[13]。在基因簇3'端是orf14.9基因，主要參與嗜熱鏈球菌的細胞生長[14]。雖然基因簇中的一些基因的準確功能目前還不是特別清楚，但是前人的研究表明epsA和epsB對EPS基因簇具有調控作用，eps1C和eps1D決定EPS基因簇的長度[13]。epsE基因編碼糖基磷酸鹽轉移酶，主要參與EPS基礎重復單元的組裝[13]。epsF基因主要參與莢膜多糖和多糖O抗原的合成。epsG和epsH基因分別編碼半乳糖基轉移酶和糖基轉移酶。在基因簇末端，epsI基因編碼參與EPS重復單元輸出的催化酶，epsJ基因催化EPS重復單元轉換為呋喃糖[15]。

圖3 ND-07的EPS基因簇

需要特別說明的是，在ND-07的EPS基因簇中含有兩對epsC-epsD基因(eps1C-eps1Dandeps2C-eps2D)。我們知道epsC和epsD基因與EPS鏈的長度相關[16]，EPS基因簇中含有兩對epsC-epsD基因表明菌株可以生產(chǎn)出兩種不同鏈長的EPS。因此，ND-07的EPS基因簇中含有兩對epsC-epsD基因可能表明ND-07可以合成出兩種不同分子量大小的EPS。Wu等人首次在S.thermophilusASCC 1275基因組中發(fā)現(xiàn)了EPS基因簇中含有兩對epsC-epsD基因，并認為這兩對epsC-epsD基因與莢膜多糖和黏液多糖的合成相關[17]。S.thermophilusASCC 1275是一種重要的乳品發(fā)酵劑菌株，它是目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)EPS能力最強的一株S.thermophilus[17]?；蚪M共線性分析發(fā)現(xiàn)ND-07的EPS基因簇序列與S.thermophilusASCC 1275的EPS基因簇序列具有高度序列相似性和共線性，由此我們推斷ND-07基因組中的EPS基因簇同樣是一個富產(chǎn)EPS的基因簇，并且可以產(chǎn)生兩種分子量大小的EPS：莢膜多糖和黏液多糖。

3 結論

通過與商業(yè)化菌株YX-S比較，發(fā)現(xiàn)ND-07具有黏度高，持水性好等優(yōu)良發(fā)酵特性，這些特性均與菌株富產(chǎn)EPS相關。全基因組分析發(fā)現(xiàn)，ND-07基因組中含有一個20.5-kb的EPS基因簇，其中包含兩對決定EPS鏈長度的epsC-epsD基因，表明ND-07可以產(chǎn)生兩種EPS：莢膜多糖和黏液多糖。本研究在分子水平揭示了菌株富產(chǎn)EPS的深層機制，為ND-07的商業(yè)化開發(fā)奠定了基礎。

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