李婉如，陳靜，汪超，李阜爍，袁芳豪，占東升，梁世排，張少輝,2

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江 溫州 325800；3.浙江熊貓乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，浙江 溫州 325800）

0 引 言

牛乳中最具營養(yǎng)價值的是蛋白質(zhì)，而酪蛋白又是牛乳蛋白中的主要組成部分，約占80%，被稱為牛乳體系中質(zhì)量最高的蛋白。酪蛋白獨(dú)特的氨基酸組成是嬰幼兒成長所必需的，也是多種生物活性多肽的豐富來源，這些生物活性多肽在人體心血管、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中均扮演著重要的角色[1]。

酪蛋白的水解產(chǎn)物被多次報道具有抗氧化能力。Suetsuna K等[2]從酪蛋白水解物中分離出一種生物活性多肽YFYPEL，該多肽被驗(yàn)證具有很強(qiáng)的體外[DPPH·]自由基清除能力和羥基自由基清除能力。Li Z等[3]對比檢測了山羊奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白水解物及從中鑒定得到的寡肽三者的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)山羊酪蛋白水解物的抗氧化活性相比未水解前提高了近300倍，五個抗氧化活性多肽其活性相比山羊酪蛋白也有不同程度的提高。

本課題組前期研究利用瑞士乳桿菌分解牛奶酪蛋白時，從水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了三種具有相同氨基酸結(jié)構(gòu)的多肽DELQ、DELQDKIH和DELQDKIHPF。為了探索這三種多肽是瑞士乳桿菌分解牛奶酪蛋白產(chǎn)生的中間產(chǎn)物還是最終發(fā)揮活性的功能性物質(zhì)，本文從功能活性方面來探究這一現(xiàn)象的機(jī)理，利用DPPH法和ABTS法測定體外抗氧化能力，進(jìn)而探究多肽的氨基酸種類、數(shù)量和排列順序與其抗氧化能力之間的關(guān)系，為開發(fā)具有抗氧化功能、增強(qiáng)免疫活性的乳制品、保健品等奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

1,1-二苯基-2-三硝基苯苦肼（DPPH自由基），總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS自由基）包括：（1）1 mL ABTS溶液；（2）1 mL氧化劑溶液；（3）0.5 mL Trolox溶液（水溶性維生素E），人工合成多肽DELQ、DELQDKIH和DELQDKIHPF。

1.2 設(shè)備

分析天平，96孔培養(yǎng)板，Tecan infinite M200 pro酶標(biāo)儀

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

0.1 mmol/L[DPPH·]甲醇溶液：稱取19.72 mg DPPH晶體，溶解在500 mL甲醇中，可配得0.1 mmol/L[DPPH·]甲醇溶液，注意避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

ABTS工作液：按1∶1的比例混合ABTS溶液與ABTS氧化劑溶液配制成ABTS工作母液，于室溫下避光靜置12-16 h后方可使用，注意避光保存，可用2～3 d。實(shí)驗(yàn)前，用PBS把ABTS工作母液稀釋成工作液，稀釋條件是使ABTS工作液的在734 nm的波長下吸光值減去相應(yīng)的PBS空白對照后為0.7±0.05，稀釋完成后工作液避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 目標(biāo)多肽的選擇

在瑞士乳桿菌分解牛奶酪蛋白的基礎(chǔ)研究結(jié)果中選擇具有相同氨基酸結(jié)構(gòu)的相似多肽，進(jìn)行抗氧化活性測定。

1.3.3 DPPH法測定多肽的抗氧化能力

根據(jù)表1，將各組別合成多肽配制成3個濃度，按1∶1的比例加入0.1 mmol/L[DPPH·]甲醇溶液，于室溫下避光靜置反應(yīng)30 min，取200 μL反應(yīng)溶液于96孔板，設(shè)5個復(fù)孔。在517 nm波長下測定吸光值。

表1 測定合成多肽清除DPPH自由基的體外抗氧化能力

清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A0——空白對照組的吸光值，As——樣品組的吸光值

1.3.4 ABTS法測定多肽的體外總抗氧化能力

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：根據(jù)表2，將10 mol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成8個濃度。取10 μL與200 μL ABTS工作液混合加入96孔板，設(shè)5個復(fù)孔，空白對照為10 μL PBS和200 μL ABTS工作液的混合。輕輕搖晃1 min，室溫孵育4 min后，在734 nm波長下測定吸光值。

表2 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制

合成多肽ABTS體外總抗氧化能力的測定：根據(jù)表3，將各組別合成多肽配制成5 mg/mL溶液。取10 μL與200 μL ABTS工作液混合加入96孔板，設(shè)5個復(fù)孔，空白對照為10 μL PBS和200 μL ABTS工作液的混合。輕輕搖晃1 min，室溫孵育4 min后，在734 nm波長下測定吸光值。

表3 ABTS法測定合成多肽的總抗氧化能力

總抗氧化能力的計(jì)算公式如下：

總抗氧化能力（mmol/g）=CTrolox/Cs

式中：CTrolox——與樣品吸光值相同的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mmol/L）

Cs——合成多肽樣品的濃度（mg/mL）

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)多肽的確定

本課題基礎(chǔ)研究對瑞士乳桿菌發(fā)酵牛奶酪蛋白的粗分離物經(jīng)消化處理后得到的產(chǎn)物進(jìn)行了超高效液相色譜-質(zhì)譜分析，最終選擇三種具有相同氨基酸結(jié)構(gòu)的多肽DELQ、DELQDKIH和DELQDKIHPF。圖1、圖2和圖3分別是DELQ、DELQDKIH和DELQDKIHPF的質(zhì)譜圖結(jié)果。經(jīng)Masslynx軟件分析，多肽序列DELQ、DELQDKIH和DELQDKIHPF分別為β-casein的第43-46、43-50和43-52位的氨基酸殘基，氨基酸序列分別為Asp-Glu-Leu-Gln、Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His和Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-Pro-Phe，分子量大小分別為503.23 u、996.50 u和1241.38 u。發(fā)現(xiàn)這三種多肽均含有相同的氨基酸結(jié)構(gòu)DELQ，且DELQDKIH和DELQDKIHPF包含了DELQ，DELQDKIHPF又包含了DELQDKIH。瑞士乳桿菌水解酪蛋白產(chǎn)生的多肽大多都是為生命活動所利用的有益物質(zhì)，其中發(fā)現(xiàn)的這三種多肽是瑞士乳桿菌水解酪蛋白過程中的中間產(chǎn)物還是水解產(chǎn)生的最終發(fā)揮活性的功能性物質(zhì)，值得進(jìn)一步探索。

2.2 DPPH法測定多肽抗氧化能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 質(zhì)荷比為504.23的DELQ一級質(zhì)譜圖

圖2 質(zhì)荷比為449.21的DELQDKIH一級質(zhì)譜圖

圖3 質(zhì)荷比為621.31的DELQDKIHPF一級質(zhì)譜圖

分別測定合成多肽DELQ、DELQDKIH、DELQD?KIHPF體外清除[DPPH·]自由基的能力。結(jié)果如圖4和圖5所示，相對于空白組來說，三種多肽的吸光值均有一定程度的降低，均顯示出一定的清除[DPPH·]自由基能力。并且對于每種多肽來說，多肽的清除[DPPH·]自由基能力都與濃度呈一定的正相關(guān)，在0.50-2.00 mg/mL范圍內(nèi)，隨著多肽濃度的降低，其清除自由基的能力也有所減弱。圖1所示，在一定濃度范圍內(nèi)，DELQDKIH清除[DPPH·]自由基的能力整體略高于DELQ和DELQDKIHPF，而圖2更直觀地從清除[DPPH·]自由基的IC50值顯示了DELQDKIHPF較強(qiáng)的抗氧化能力。

這三種多肽DELQ、DELQDKIH、DELQDKIHPF清除[DPPH·]自由基的能力應(yīng)該得益于末端的天冬氨酸（Asp）和亮氨酸（Leu）。Tsuge N[4]通過研究證明氨基酸本身的性質(zhì)對組成多肽生物活性具有一定影響，Asp等極性氨基酸可以通過側(cè)鏈的氨基或是羰基進(jìn)行螯合作用進(jìn)而抑制自由基的氧化。Giménez B等[5]研究亮氨酸（Leu）和羥脯氨酸（Hyp）殘基對多肽序列的抗氧化活性影響時，用Leu和Hyp殘基分別取代序列Gly-Pro-X-Gly-X-X-Gly-Phe-X-Gly-Pro-X-G ly-X-Ser中的X位置，以及Leu部分取代X位置后，測定三種多肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)Leu取代X位置的多肽其總抗氧化能力（ABTS法）遠(yuǎn)高于其它兩種多肽。

圖4 合成多肽清除DPPH自由基的體外抗氧化能力

圖5 合成多肽清除DPPH自由基的IC50值

而相對于DELQ，DELQDKIH和DELQDKIHPF兩者體外清除[DPPH·]自由基的能力較高，這應(yīng)該歸功于他們的兩端暴露的組氨酸（His）和芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe）。有研究從大豆水解物[6]和雞蛋白的蛋白水解物[4]中分離提取得到抗氧化肽，其抗氧化活性被歸功于His，因?yàn)镠is的咪唑基團(tuán)具有提供質(zhì)子的能力。研究表明，抗氧化活性不僅與His是否存在有關(guān)，還與His殘基存在的數(shù)量和位置有很大的關(guān)系，如HDHPVC的抗氧化活性相比HEKVC強(qiáng)很多，可能與His殘基在抗氧化活性多肽中的數(shù)量有關(guān)系[7]。Saiga A等[8]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)His處于多肽序列的中間時，其抗氧化活性明顯增強(qiáng)。Huaming Chen等[9]設(shè)計(jì)比較28種來源于大豆蛋白的多肽清除[DPPH·]自由基實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組氨酸（His）和脯氨酸（Pro）在多肽的抗氧化生物活性中扮演著極其重要的角色，在所有的這些合成多肽中，清除[DPPH·]自由基能力最強(qiáng)的多肽序列為Pro-His-His。而芳香族氨基酸的暴露能顯著地提高生物活性肽的抗氧化能力。Rojas-Ronquillo R等[10]從酸奶中分離得到了一個含有17個氨基酸的多肽YQEPVLGPVRGPFPIIV，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)消化酶降解的酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸暴露在兩端的多肽比其他多肽表現(xiàn)出更好的抗氧化能力。Yamaguchi N[11]也在研究氨基酸對脂類抗氧化能力的實(shí)驗(yàn)中證明，在20種氨基酸中酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）表現(xiàn)出了顯著抑制亞油酸氧化的抗性，說明芳香族氨基酸本身就具有較好的抗氧化活性。

2.3 ABTS法測定多肽總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

ABTS在活性氧、羥基自由基、過氧化氫和超氧自由基等氧化劑作用下會被氧化成綠色的ABTS+，而當(dāng)有抗氧化活性的物質(zhì)存在時便能夠抑制這種氧化反應(yīng)，阻止ABTS+的產(chǎn)生。在734 nm處測定反應(yīng)液的吸光值，可以得到ABTS+生成量，并通過公式計(jì)算出多肽的總抗氧化能力。通常吸光值越小，證明生成的綠色的ABTS+越少，說明該物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。其中，Trolox（水溶性維生素E）為參考物質(zhì)，其總抗氧化能力為1，在相同濃度下，被測物質(zhì)的抗氧化能力可以其抗氧化能力和Trolox相比的倍數(shù)來表示。

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果如圖6所示，通過Excel的線性擬合，可見Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.9973。說明Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的精確度和準(zhǔn)確度都符合檢測要求，能被用于后續(xù)計(jì)算。

圖6 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 合成多肽的ABTS體外總抗氧化能力測定

分別測定合成多肽DELQ、DELQDKIH、DELQDKIHPF體外總抗氧化能力，結(jié)果如圖7所示。相對于空白組來說，三種多肽都表現(xiàn)出了一定的抗氧化能力，總抗氧化力大小為DELQ﹤DELQDKIH﹤DELQDKIHPF。

圖7 合成多肽的體外總抗氧化能力

DELQDKIHPF的抗氧化活性相對于DELQD?KIH強(qiáng)一些，是因?yàn)楹懈彼幔≒ro）的一些多肽被認(rèn)為具有很強(qiáng)的抗氧化能力，脯氨酸（Pro）通過其側(cè)鏈的吡咯環(huán)阻止肽段的折疊纏繞，打斷多肽的二級結(jié)構(gòu)，而這些二級結(jié)構(gòu)會抑制多肽發(fā)揮活性，從而使多肽暴露更多的位點(diǎn)或側(cè)鏈用于抗氧化反應(yīng)[12-13]。本研究中天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）、組氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）和脯氨酸（Pro）這些氨基酸殘基的存在會增強(qiáng)多肽序列的抗氧化能力，使多肽可作為抗氧化物質(zhì)使用。此外，還有研究報道，被稱為抗氧化劑氨基酸的色氨酸（Trp），酪氨酸（Tyr），甲硫氨酸（Met）和半胱氨酸（Cys）也都被認(rèn)為是抗氧化活性多肽中的典型氨基酸[14]。疏水性殘基包括纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和異亮氨酸（Ile）因其特殊的結(jié)構(gòu)，能通過增強(qiáng)多肽在脂質(zhì)中的溶解性，從而更好地與自由基發(fā)生反應(yīng)，最終抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[15-16]。Lin S等[17]測定了QCHKP、QCHQP、KCHKP和KCHQP 4種多肽的抗氧化活性，結(jié)果顯示QCHKP﹤QCHQP﹤KCHKP﹤KCHQP，發(fā)現(xiàn)K和Q的位置及數(shù)量變化對于抗氧化活性是有一定影響的，當(dāng)K和Q處于肽段序列中間時，Q的多肽抗氧化活性強(qiáng)于K的；當(dāng)K和Q位于肽段C端時，K的多肽抗氧化活性反而強(qiáng)于Q的。

綜上，雖然DELQ、DELQDKIH和DELQDKIH?PF這三種多肽的氨基酸組成相似，具有包含與被包含的關(guān)系，分子量也依次增大，且都含有一些已經(jīng)被證明具有抗氧化能力的氨基酸，但連接成肽段后所表現(xiàn)出的抗氧化活性卻不相同，呈現(xiàn)依次增大的態(tài)勢。盧珊珊等[18]利用瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳獲得生物活性多肽QEPVL及其降解產(chǎn)物QEPV，經(jīng)過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)和體外免疫功能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證QEPV相比QEPVL具有更強(qiáng)的抗氧化活性和促進(jìn)細(xì)胞免疫的活性。Su?etsuna K[2]從酶解的酪蛋白產(chǎn)物中分離得到活性多肽YFYPEL，在研究其構(gòu)效關(guān)系時，分別對EL，PEL，YPEL，F(xiàn)YPEL和YFYPEL這5種形式做抗氧化活性分析，結(jié)果表明PEL﹤YPEL﹤FYPEL﹤YFYPEL﹤EL。雖然由具有相似作用的氨基酸組成，但他們還是表現(xiàn)出一定的活性差異，說明氨基酸只有分布在肽段的合適位點(diǎn)才能有效地提高多肽的活性，EL的最高抗氧化能力則被解釋為其作用核心片段的暴露。本文中DELQ肽段最短，抗氧化活性卻不是最強(qiáng)；DELQDKI?HPF肽段最長，抗氧化活性卻是最強(qiáng)的。由此可以推斷，DELQ不是瑞士乳桿菌水解酪蛋白產(chǎn)生的最終發(fā)揮最強(qiáng)活性的功能性核心片段，DELQDKIH和DELQDKIHPF的可能性也不大，三者多數(shù)是瑞士乳桿菌水解過程中的中間產(chǎn)物。結(jié)果表明，多肽的抗氧化能力與氨基酸的種類、數(shù)量和排列順序等都密切相關(guān)，通?？寡趸芰^高的氨基酸暴露在肽段兩端會使其顯示較好的抗氧化活性[19]。

此外，分子的抗氧化性質(zhì)取決于許多因素，如直接清除活性氧的能力，提供氫原子或?qū)㈦娮愚D(zhuǎn)移到自由基化合物的能力以及螯合過渡金屬如銅和鐵的能力[20]。DPPH法和ABTS法這兩種體外抗氧化能力的測定方法并沒有直接一對一的對應(yīng)關(guān)系，兩者原理不同，前者是淬滅自由基以阻止氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生，后者基于清除各種活性氧以抑制活性氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而且兩者都屬于體外的表觀指標(biāo)，真正的抗氧化活性確定還需要進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇前期研究瑞士乳桿菌發(fā)酵牛奶酪蛋白產(chǎn)生的三種具有相同氨基酸結(jié)構(gòu)的多肽DELQ、DELQDKIH和DELQDKIHPF，利用DPPH法和ABTS法測定了抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種多肽都表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，活性大小順序?yàn)镈ELQ＜DELQDKIH＜DELQDKIHPF，在一定濃度范圍內(nèi)，抗氧化活性隨著濃度的增大而增大。且三者多數(shù)是瑞士乳桿菌分解牛奶酪蛋白產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，而非最終功能性物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上從抗氧化多肽的氨基酸種類、數(shù)量和排列順序等方面探究了其與多肽抗氧化活性之間的關(guān)系，探索了抗氧化肽的抗氧化機(jī)理。不過這三種抗氧化肽的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)仍有待進(jìn)一步開展和完善，為今后抗氧化肽保健品、化妝品以及藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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