苗鳳華，陳曉，石磊，馬筱慧

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春 130021）

原發(fā)性肝癌是中老年人的常見(jiàn)病[1]，預(yù)后較差[2-4]。CD44是近些年研究較熱的一個(gè)腫瘤標(biāo)志物[5-8]，其可與組織間隙中微靜脈末端的高柱狀內(nèi)皮細(xì)胞表面的透明質(zhì)酸結(jié)合，在淋巴細(xì)胞回歸到黏膜和引流淋巴結(jié)中具有重要作用。CD44蛋白可以募集CD8+T細(xì)胞等向局部組織轉(zhuǎn)移，而CD8+T細(xì)胞可以分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，因此可能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。但目前關(guān)于CD44基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌患者局部組織中T細(xì)胞亞群的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

前瞻性收集2017年1月-2017年12月吉林大學(xué)第一醫(yī)院收治的原發(fā)性肝癌患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性肝癌（確診依據(jù)為病理診斷）；有手術(shù)適應(yīng)證，可行手術(shù)治療；年齡18～75歲；同意參與本研究，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；復(fù)發(fā)性肝癌；肝﹑腎﹑心﹑腦﹑肺等重要臟器功能不全；感染性疾??；血液系統(tǒng)疾?。荒δ苷系K；術(shù)前接受新輔助化療等特殊治療；3個(gè)月內(nèi)曾使用免疫調(diào)節(jié)劑；免疫功能不全；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不宜行手術(shù)治療的晚期肝癌患者。研究期間共納入原發(fā)性肝癌患者109例，根據(jù)CD44基因rs4756195位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，將患者分為AA組﹑AG組和GG組，分別為67﹑23和19例。

1.2 觀察指標(biāo)

主要觀察指標(biāo)為腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞﹑CD8+T細(xì)胞﹑Treg細(xì)胞﹑Th17細(xì)胞。次要觀察指標(biāo)為白介素 -2（interleukin-2, IL-2）﹑白介素 -10（interleukin-10,IL-10）﹑腫瘤生長(zhǎng)因子-β（tumor growth factor-β,TGF-β）和白介素-17（interleukin-17, IL-17）。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù) 術(shù)中留取原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本（距離肝癌邊緣＞1 cm的肝癌組織），使用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman coulter公司Epics XL型）檢測(cè)CD4+T﹑CD8+T﹑Treg及Th17細(xì)胞。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-2﹑IL-10﹑TGF-β和IL-17，相關(guān)單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，抗體比例1∶80。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)算，其中不著色﹑淺黃色﹑棕黃色﹑黃褐色分別為0﹑1﹑2和3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為＜10%﹑10%～＜40%﹑40%～＜70%﹑≥70%分別計(jì)0﹑1﹑2和3分，兩者之和為總分，總分≥2分為陽(yáng)性，＜2分為陰性。

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR） 根據(jù)HapMap中國(guó)人數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Haploview軟件。選定CD44基因rs4756195位點(diǎn)作為檢測(cè)位點(diǎn)，應(yīng)用PCR確定個(gè)體基因型，相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

3組患者年齡﹑性別﹑TMN分期﹑腫瘤直徑及分化程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組患者一般情況比較

2.2 肝癌組織中CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞的表達(dá)

2.2.1 CD4+T細(xì)胞 AA組﹑AG組﹑GG組患者CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.873，P=0.003）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，AG組﹑GG組患者CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平低于AA組（P＜0.05）；AG組與GG組患者CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.2.2 CD8+T細(xì)胞 AA組﹑AG組﹑GG組患者CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.175，P=0.001）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，AG組﹑GG組患者CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平低于AA組（P＜0.05）；AG組與GG組患者CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 肝癌組織中Treg和Th17細(xì)胞的表達(dá)

2.3.1 Treg細(xì)胞 AA組﹑AG組﹑GG組患者Treg細(xì)胞的表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.546，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，AG組﹑GG組患者肝癌組織中Treg水平高于AA 組（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

2.3.2 Th17細(xì)胞 AA組﹑AG組﹑GG組患者Th17細(xì)胞的表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.985，P=0.378）。見(jiàn)表 3。

表2 3組患者肝癌組織中CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞表達(dá)水平比較 （%，±s）

表2 3組患者肝癌組織中CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞表達(dá)水平比較 （%，±s）

AA組（n =67） 21.08±2.12 28.83±2.52 AG組（n =23） 19.43±1.98 25.52±2.71 GG組（n =19） 19.12±2.09 24.91±2.29 F值 5.873 6.175

表3 3組患者肝癌組織中Treg和Th17細(xì)胞表達(dá)水平比較 （%，±s）

表3 3組患者肝癌組織中Treg和Th17細(xì)胞表達(dá)水平比較 （%，±s）

AA組（n =67） 6.12±1.47 1.64±0.42 AG組（n =23） 8.12±1.71 1.54±0.38 GG組（n =19） 8.24±1.92 1.55±0.37 F值 7.546 1.985

2.4 肝癌組織中IL-2、IL-10、TGF-β及IL-17的陽(yáng)性表達(dá)

AA組﹑AG組﹑GG組 患 者 的 IL-2﹑IL-10﹑TGF-β陽(yáng)性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組患者IL-17陽(yáng)性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 3組患者肝癌組織中IL-2、IL-10、TGF-β及IL-17的陽(yáng)性表達(dá)率比較 例（%）

3 討論

腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性決定腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能力和轉(zhuǎn)移能力，對(duì)患者預(yù)后具有重大影響。醫(yī)學(xué)的進(jìn)步雖然使原發(fā)性肝癌患者的死亡率有所下降，生存質(zhì)量有所提高，但是其臨床預(yù)后仍不理想。目前已知原發(fā)性肝癌組織中免疫狀態(tài)對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程具有重大影響，多數(shù)肝癌組織中表現(xiàn)為免疫抑制狀態(tài)，為癌細(xì)胞的免疫逃脫提供了良好的條件。T細(xì)胞亞群是腫瘤組織中的重要免疫成分，良好的免疫功能狀態(tài)可以有效殺滅腫瘤細(xì)胞，抑制其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前研究較熱的腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞亞群主要包括CD4+T﹑CD8+T﹑Treg和Th17細(xì)胞。研究證實(shí)，在原發(fā)性肝癌患者中上述T細(xì)胞亞群功能失衡，例如Treg細(xì)胞升高，可以抑制免疫系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用[9-10]。

CD44基因rs4756195位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)原發(fā)性肝癌患者的影響主要通過(guò)影響CD44蛋白的合成，從而發(fā)揮生理作用。CD44蛋白是一種細(xì)胞黏附分子，在腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞表面表達(dá)，主要通過(guò)結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原蛋白﹑層黏連蛋白﹑硫酸軟骨素等，從而發(fā)揮其生理作用，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的歸巢﹑淋巴細(xì)胞向炎癥部位和黏膜相關(guān)淋巴組織歸位﹑黏附細(xì)胞外基質(zhì)。CD44蛋白可以募集CD8+T細(xì)胞等向局部組織轉(zhuǎn)移[11-12]。而CD8+T細(xì)胞可以分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其是殺傷腫瘤細(xì)胞的重要免疫細(xì)胞[13-14]，因此可能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。另外，CD44還可以通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞向抗原呈遞細(xì)胞遷移﹑增強(qiáng)T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)；其還可以通過(guò)調(diào)節(jié)TCR/CD復(fù)合體信號(hào)通路，以T細(xì)胞活化的共刺激因子身份，參與T細(xì)胞的活化。最后，CD44還可以通過(guò)延長(zhǎng)T細(xì)胞的壽命，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)。目前尚無(wú)研究探討CD44基因rs4756195位點(diǎn)多態(tài)性與肝癌組織中T細(xì)胞亞群相關(guān)性的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，CD44基因rs4756195的多態(tài)性分布與原發(fā)性肝癌組織中T細(xì)胞亞群的分布有關(guān)，表現(xiàn)為CD44 rs4756195基因型為AG﹑GG的野生型患者CD4+T﹑CD8+T細(xì)胞表達(dá)降低，Treg升高，IL-2降低，而TGF-β﹑IL-10升高。IL-2是促炎因子，由活化的免疫性T細(xì)胞分泌，又可刺激T活性細(xì)胞的募集和增殖；TGF-β﹑IL-10則是免疫抑制因子，可以抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)。IL-2降低，TGF-β﹑IL-10升高表明機(jī)體處于一種免疫抑制狀態(tài)，提示原發(fā)性肝癌組織中CD44 rs4756195基因型為AG﹑GG的野生型患者局部免疫抑制狀態(tài)更嚴(yán)重。在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移﹑原發(fā)性肝癌等患者中，也證實(shí)CD44基因的多態(tài)性對(duì)腫瘤的生物學(xué)特性有重要影響[15-19]。我國(guó)學(xué)者周鑫等[20]在乳腺癌的研究中也證實(shí)，CD44 rs4756195基因型為AG﹑GG的野生型人群更容易發(fā)生乳腺癌，且發(fā)展更快，預(yù)后更差。

綜上所述，原發(fā)性肝癌患者CD44基因rs4756195位點(diǎn)呈多態(tài)性分布，與肝癌組織中的免疫抑制有關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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