劉向東，李慧，王成志，趙煥東，肖平

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.湖南省長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院 呼吸科，湖南 長(zhǎng)沙 410005；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

甲基蓮心堿（Neferine, Nef）是從蓮子心中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿[1-2]。研究表明，其具有抗癌﹑抗血栓形成﹑減輕急性腎損傷﹑抑制炎癥和氧化應(yīng)激等生物學(xué)作用[1-7]。但對(duì)于Nef在糖尿病腎病中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究以高糖培養(yǎng)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞（normal rat kidney proximal tubular epithelial cell, NRK-52E）復(fù)制糖尿病體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8-9]。采用Nef進(jìn)行干預(yù)，觀察細(xì)胞活力﹑血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1, HO-1）和氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，探究Nef在糖尿病腎病中的作用及其機(jī)制。見(jiàn)圖 1﹑2。

圖1 Nef化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2 NRK-52E細(xì)胞 （×100）

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

NRK-52E細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（中國(guó)杭州四季青生物工程材料有限公司），Nef（中國(guó)大連美侖生物技術(shù)有限公司），D-無(wú)水葡萄糖（中國(guó)北京索萊寶科技有限公司），鋅原卟啉Ⅸ（zinc protoporphyrin Ⅸ, ZnP）和甘露醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，HO-1抗體和P67抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，β-actin抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），CCK-8（日本同仁化學(xué)研究所），總膽紅素（total bilirubin,TB）﹑活性氧（reactive oxygen species, ROS）及丙二醛（malondialdehyde, MDA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成生物工程研究所。細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司），電泳儀（美國(guó)BIORAD公司），F(xiàn)luor Chem R多功能成像分析系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，于37℃﹑5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1﹑2天更換培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80%時(shí)，按1∶3～1∶5進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為6組：①對(duì)照組，用正常葡萄糖濃度（5.5 mmol/L）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，不予特殊處理；②高滲組，在對(duì)照組中加入38.9 mmol/L甘露醇，作為滲透壓對(duì)照[8]；③高糖組，加入無(wú)水葡萄糖使DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖濃度達(dá)44.4 mmol/L，作為糖尿病腎病體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8-9]；④Nef組，在高糖組中加入2μmol/L Nef；⑤HO-1抑制劑組，在Nef組中加入10μmol/L HO-1特異性酶活性抑制劑ZnP；⑥ZnP組：對(duì)照組中加入10μmol/L ZnP。上述各組干預(yù)時(shí)間均為24 h。

1.2.3 CCK-8法 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。取對(duì)數(shù)期NRK-52E細(xì)胞種植于96孔板，細(xì)胞密度2 000個(gè)/孔，培養(yǎng)12 h后進(jìn)行換液，加入含不同處理組藥物的培基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再加入10μl CCK-8試劑于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處吸光度。上述實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)≥3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 采用 Western blot檢測(cè)HO-1和P67的表達(dá)。使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞，收集蛋白樣品。使用10% SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，再將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移（250 mA，2 h）至0.45μm孔徑的PVDF膜；用含5%胎牛血清白蛋白的TBST封閉2 h；隨后于4℃孵育一抗過(guò)夜（HO-1比例1∶20 000，P67和β-actin比例1∶2 000）。用TBST洗膜3次，10min/次，加入二抗于室溫孵育1 h；TBST洗膜洗膜3次，10min/次，最后使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影，用Alpha-View軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 DCFH-DA探針 采用DCFH-DA探針檢測(cè)ROS。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)穩(wěn)定12 h后換液，加入含不同處理組藥物的培基繼續(xù)培養(yǎng)21 h，再加入8μmol/L DCFH于37℃孵育3 h，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS漂洗2遍，加入無(wú)EDTA的胰酶消化后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS再次漂洗2遍，加入PBS重懸（細(xì)胞密度10×106個(gè)/ml），最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)（激發(fā)波長(zhǎng)500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm），采用Flowjo 7.6軟件進(jìn)行結(jié)果分析[10-12]。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 TB和MDA的檢測(cè) 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)穩(wěn)定12 h后換液，加入含不同處理組藥物的培基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別定量檢測(cè)TB和MDA，并使用細(xì)胞總蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（nmol/mg）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nef對(duì)高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞活力的影響

對(duì)照組﹑ZnP組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑制劑組的細(xì)胞活力分別為（100.00±8.33）%﹑（84.18±6.64）%﹑（91.30±10.62）%﹑（73.88±7.82）%﹑（108.16±12.12）%和（84.26±11.57）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.837，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，ZnP組﹑高滲組的細(xì)胞活力與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高糖組細(xì)胞活力低于對(duì)照組和Nef組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組細(xì)胞活力低于Nef組（P＜0.05）。

對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞活力為（100.00±10.71）%，0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0﹑4.0﹑6.0﹑8.0 和 16.0μmol/L Nef組 的 細(xì) 胞 活 力 分 別 為（76.67±9.99）%﹑（81.11±7.68）%﹑（90.11±7.41）%﹑（103.81±15.81）%﹑（114.08±10.19）%﹑（116.21±5.59）%﹑（94.30±7.11）%和（53.16±7.29）%，經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.333，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，0.0μmol/L Nef組細(xì)胞活力低于對(duì)照組（P＜0.05）；16.0μmol/L組細(xì)胞活力低于 0.0μmol/L Nef組（P＜0.05）；2.0﹑4.0﹑6.0和 8.0μmol/L Nef組細(xì)胞活力均高于0.0μmol/L Nef組。見(jiàn)圖3。

2.2 Nef對(duì)HO-1和P67蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 HO-1蛋白 對(duì)照組HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.00），0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0 和 4.0μmol/L Nef組HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.34±0.10）﹑（1.58±0.30）﹑（2.22±0.47）﹑（2.96±0.39）和（3.62±0.19），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.778，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，0.0μmol/L Nef組HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；1.0﹑2.0和 4.0μmol/L Nef組HO-1蛋白表達(dá)水平高于 0.0μmol/L Nef組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 不同濃度Nef對(duì)NRK-52E細(xì)胞活力的影響 （±s）

圖4 不同濃度Nef對(duì)HO-1和P67蛋白表達(dá)的影響

2.2.2 P67蛋白 對(duì)照組P67蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.00），0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0 和 4.0μmol/L Nef組P67蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（2.02±0.21）﹑（1.70±0.13）﹑（1.56±0.08）﹑（1.31±0.09） 和（1.16±0.15），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.728，P=0.000）（見(jiàn)圖4）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，0.0μmol/L Nef組P67蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；0.5﹑1.0﹑2.0和4.0μmol/L Nef組P67蛋白表達(dá)水平低于0.0μmol/L Nef組（P＜0.05）。對(duì)照組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑制劑組﹑ZnP組的P67蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.00）﹑（1.08±0.17）﹑（1.75±0.15）﹑（1.32±0.22）﹑（1.98±0.13）和（1.19±0.03），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.629，P=0.000）（見(jiàn)圖 5）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，高糖組P67蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；Nef組P67蛋白表達(dá)水平低于高糖組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組P67蛋白表達(dá)水平高于 Nef組（P＜0.05）。

2.3 Nef對(duì)HO-1酶活性的影響

對(duì)照組﹑ZnP組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑制劑組的HO-1酶活性分別為（0.75±0.13）﹑（0.57±0.10）﹑（0.87±0.17）﹑（1.07±0.11）﹑（2.90±0.29）和（0.66±0.12）nmol/mg，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.536，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，高糖組HO-1酶活性高于對(duì)照組（P＜0.05）；Nef組HO-1酶活性高于高糖組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組HO-1酶活性低于Nef組（P＜0.05）。

對(duì)照組HO-1酶活性（0.75±0.13）nmol/mg，0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0和 4.0μmol/L Nef組 的 HO-1酶 活 性分 別 為（1.07±0.11）﹑（1.46±0.20）﹑（2.03±0.24）﹑（2.90±0.29）和（3.52±0.35）nmol/mg，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=63.828，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，0.0μmol/L Nef組HO-1酶活性與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；1.0﹑2.0和4.0μmol/L Nef組的HO-1酶活性高于0.0μmol/L Nef組（P＜0.05）。見(jiàn)圖 6。

2.4 Nef對(duì)高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞ROS水平的影響

對(duì)照組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑制劑組﹑ZnP組的ROS分別為（1539.16±882.07）﹑（2564.16±1550.08）﹑（13342.50±1952.24）﹑（5077.83±611.45）﹑（16175.83±678.36）和（2248.16±1592.09），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.496，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，高糖組ROS水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；Nef組ROS水平低于高糖組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組ROS水平高于Nef組（P＜0.05）。見(jiàn)圖 7。

2.5 Nef對(duì)MDA的影響

對(duì)照組﹑ZnP組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑 制 劑 組 的 MDA分 別 為（0.381±0.036）﹑（0.536±0.031）﹑（0.492±0.039）﹑（0.914±0.093）﹑（0.472±0.070） 和（1.038±0.088）nmol/mg， 經(jīng) 方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.016，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，高糖組MDA水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；Nef組MDA水平低于高糖組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組MDA水平高于Nef組（P＜0.05）。

圖5 不同處理組P67蛋白表達(dá)水平比較

圖6 不同濃度Nef對(duì) HO-1酶活性的影響 （±s）

圖7 不同處理組ROS的變化

3 討論

氧化應(yīng)激在組織器官損傷和功能障礙中扮演重要角色[13]。過(guò)高的ROS可使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)﹑脂質(zhì)和核酸出現(xiàn)過(guò)氧化損傷，并引起細(xì)胞代謝障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，甚至出現(xiàn)壞死或凋亡[13-16]。在糖尿病中，NADPH氧化酶活性增加﹑線粒體功能障礙等導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多，而超氧化物歧化酶﹑過(guò)氧化氫酶﹑谷胱甘肽過(guò)氧化物酶功能下降又引起ROS清除障礙，最終導(dǎo)致ROS產(chǎn)生并積聚，使機(jī)體持續(xù)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[14-15,17]。在糖尿病腎臟，ROS可直接損傷濾過(guò)屏障﹑足細(xì)胞﹑內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，還可通過(guò)激活多元醇途徑和蛋白激酶C，促進(jìn)糖基化產(chǎn)物形成及腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致糖尿病腎病[8，14，18]。目前臨床上常使用硫辛酸﹑維生素E等抗氧化劑進(jìn)行抗氧化應(yīng)激治療，但療效有限，因此尋找更安全有效的抗氧化應(yīng)激藥物是當(dāng)務(wù)之急[19]。

已知中藥蓮子心具有解熱﹑鎮(zhèn)痛﹑止血?jiǎng)┑裙πАef是蓮子心的重要活性成分。以往研究表明，其具有抗癌﹑抗心律失常﹑抗血栓形成﹑抗纖維化﹑抗炎﹑抗氧化應(yīng)激及抗凋亡等作用[1，6，20-21]。本研究利用高糖培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞，復(fù)制糖尿病腎病體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8]，通過(guò)檢測(cè)NADPH氧化酶﹑ROS﹑MDA及細(xì)胞活力，證實(shí)高糖可以誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，并發(fā)現(xiàn)Nef可減輕上述氧化應(yīng)激損傷。

NADPH氧化酶是產(chǎn)生ROS的主要酶，與腎臟氧化應(yīng)激密切相關(guān)，由5個(gè)亞基組成：2個(gè)膜亞基gp91﹑p22組成膜復(fù)合體，3個(gè)胞質(zhì)亞基p40﹑p47﹑p67[8]。本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)P67亞基，反映NADPH氧化酶的表達(dá)和氧化應(yīng)激。HO-1是血紅素代謝的關(guān)鍵酶，廣泛表達(dá)于全身各個(gè)組織器官，可將血紅素分解為一氧化碳CO﹑膽綠素和Fe2+，具有舒張血管﹑抗炎﹑抗氧化應(yīng)激及抗凋亡等作用[22-23]。在腎臟，HO-1主要表達(dá)于近端腎小管上皮細(xì)胞，依次是遠(yuǎn)端小管﹑集合管和髓袢，腎小球﹑足細(xì)胞和系膜細(xì)胞幾乎不表達(dá)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇NRK-52E細(xì)胞作為研究對(duì)象[24-25]。HO-1是一種蛋白酶，其抗氧化應(yīng)激功能主要由其代謝產(chǎn)物膽紅素和CO產(chǎn)生，因此在實(shí)驗(yàn)中常采用膽紅素的濃度來(lái)反映HO-1的酶活性[22，26]。HO-1抗氧化應(yīng)激作用的強(qiáng)弱除與量有關(guān)，更與酶活性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)使用的ZnP就是與HO-1酶活性中心特異性結(jié)合，從而抑制HO-1的功能，但其對(duì)HO-1的表達(dá)無(wú)抑制作用，甚至因?yàn)槊富钚韵陆担瑢?dǎo)致底物堆積，反而促進(jìn)HO-1的表達(dá)[27-28]。本研究通過(guò)檢測(cè)HO-1的表達(dá)和酶活性，并比較其在高糖組﹑Nef組和HO-1抑制劑組的變化，且同時(shí)檢測(cè)和比較該組P67的表達(dá)水平﹑細(xì)胞活力﹑ROS和MDA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nef可以誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)并增加酶活性，相應(yīng)地使P67表達(dá)下調(diào)，ROS和MDA下降，細(xì)胞活力增加；當(dāng)抑制HO-1活性后，Nef上述作用消失，由此說(shuō)明Nef具有抗氧化應(yīng)激作用，而且該作用是通過(guò)HO-1實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Nef通過(guò)誘導(dǎo)HO-1表達(dá)并增加酶活性，從而抑制NADPH氧化酶的表達(dá)，導(dǎo)致ROS減少，脂質(zhì)過(guò)氧化減弱，氧化應(yīng)激損傷減輕，從而保護(hù)細(xì)胞。不僅證實(shí)高糖可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，Nef具有抗氧化應(yīng)激作用，并探究Nef抗氧化應(yīng)激的部分機(jī)制，為臨床治療糖尿病腎病和氧化應(yīng)激損傷提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為Nef的后續(xù)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但本研究尚局限于細(xì)胞水平，且氧化應(yīng)激檢測(cè)指標(biāo)有限，也只探究了Nef抗氧化應(yīng)激作用與HO-1的關(guān)系，尚需從整體水平進(jìn)一步驗(yàn)證，并探究更多的Nef抗氧化應(yīng)激機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)：

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