王進(jìn)堂 ，Jeremy Walston，Peisong Gao，高茂龍 ，Sean X Leng，陳崢

（1.北京老年醫(yī)院 老年病臨床與康復(fù)研究所，北京 100095；2. Division of Geriatric Medicine and Gerontology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine，Baltimore 21224, USA; 3. Johns Hopkins Asthma and Allergy Center, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore 21224, USA）

α-突觸核蛋白（α-synuclein, α-syn）正常存在于突觸前神經(jīng)終端，產(chǎn)生生理功能[1]。其異常代謝或產(chǎn)物被釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，激活膠質(zhì)細(xì)胞和固有免疫反應(yīng)，引起神經(jīng)元損傷[2-4]，成為某些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制之一[5-6]。有證據(jù)表明，α-syn突變和聚合可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[4，7]，但其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用，目前仍有爭議。本研究利用α-syn及其A53T突變型檢測α-syn對(duì)Toll樣受體（toll-like receptors, TLRs） 1～4和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB, NF-κB）表達(dá)的影響，以證實(shí)其是否參與星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)劑和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Gibco公司，野生型和A53T α-syn購自美國rPeptide公司，β-Actin初級(jí)抗體﹑Alexa Fluor?514羊抗兔二級(jí)抗體﹑實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒﹑DAPI核染色劑購自美國Thermo Fisher公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標(biāo)記二級(jí)抗體（美國Cell Signaling公司），TLR-2﹑膠質(zhì)纖維原酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）﹑NF-κB初級(jí)抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

混合膠質(zhì)細(xì)胞分離于新生（3～4 d）C57BL/6小鼠的大腦皮層，根據(jù)細(xì)胞黏附程度，將星形膠質(zhì)細(xì)胞與其他細(xì)胞，如小膠質(zhì)和少突膠質(zhì)細(xì)胞分離[8]。取出大腦皮層，經(jīng)胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸浮液，在聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶及37℃﹑5%二氧化碳CO2﹑95%濕度培養(yǎng)箱中用DMEM/F12（含10% FBS﹑100u/ml青霉素﹑100μg/ml鏈霉素）培育16 h，通過劇烈搖動(dòng)和清洗，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，然后根據(jù)需要分離于多個(gè)培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至90%覆蓋時(shí)即可使用。

1.3 熒光顯微鏡觀察

在蓋玻片上培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，用冰冷的甲醇和丙酮（1∶1）溶液固定5min，予以生理鹽水PBS（pH 7.4）沖洗10～15min，2.25%甘氨酸室溫下作用20min，PBS反復(fù)沖洗后包被緩沖液（1%牛血清白蛋白﹑0.3% Triton X-100﹑10%山羊血清）室溫下作用1 h，PBS反復(fù)沖洗后用GFAP初級(jí)抗體（兔抗鼠1∶1 000）4℃過夜，PBS反復(fù)沖洗后用Alexa Fluor?514二級(jí)抗體（羊抗兔，1∶1 000）室溫下作用1 h，PBS反復(fù)沖洗后用1μg/ml DAPI進(jìn)行細(xì)胞核熒光染色10min。封片后在熒光顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)ECLIPSE Ni-U）下檢查。

1.4 細(xì)胞藥物處理

將傳代的星形膠質(zhì)細(xì)胞在6孔板上分成多個(gè)處理組，替換新鮮培養(yǎng)液，分別加入適當(dāng)濃度的藥物[7]：2和20μg/ml野生型α-syn﹑A53T突變型，留取0%藥物作為對(duì)照，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。然后按分組進(jìn)行細(xì)胞裂解液（0.5 ml/孔Trizol液）的RNA提取和蛋白裂解液（0.2 ml/孔）的蛋白質(zhì)提取，分別用于qRT-PCR和Western blot檢測。

1.5 qRT-PCR

qRT-PCR測定TLRs 1～4和NF-κB mRNA的表達(dá)水平，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的表達(dá)作為內(nèi)部參照。在分光光度計(jì)（型號(hào)NanoDrop? 2000）上嚴(yán)格按照美國Applied Biosystems公司提供的TaqMan基因表達(dá)分析程序進(jìn)行測定。目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物用美國TaqMan公司探針測定：TLR1（Mm01208874_m1），TLR2（Mm00442346_m1），TLR3（Mm00628112_m1），TLR4（Mm00445273_m1），NF-κB（Mm00476361_m1），其相對(duì)豐度用GAPDH（Mm03302249_g1）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理?；虮磉_(dá)改變=ΔCt值-GAPDH參照值，然后計(jì)算ΔΔCt和倍數(shù)差異數(shù)，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6 Western blot檢測

用Western blot檢測TLR2和NF-κB蛋白的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)部對(duì)照。用Bradford試劑（美國Bio-Rad公司）測定蛋白濃度，取30μg蛋白質(zhì)加熱至95℃變性，經(jīng)Bio-Rad電泳儀電泳和聚偏二氟乙烯膜半干轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行初級(jí)抗體（4℃過夜）和HRP結(jié)合二級(jí)抗體（室溫1 h）孵育。然后分別用增強(qiáng)化學(xué)熒光試劑盒（美國Bio-Rad公司）在暗室顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞熒光顯微鏡觀察

本研究提取的星形膠質(zhì)細(xì)胞清除了絕大多數(shù)其他細(xì)胞類型。免疫熒光分析顯示，不同形態(tài)的GFAP陽性細(xì)胞代表星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)，DAPI陽性細(xì)胞代表細(xì)胞總數(shù)。在鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，GFAP陽性細(xì)胞占（93.96±4.03）%。見圖1。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光分析

2.2 α-Syn誘導(dǎo)TLRs的表達(dá)

TLRs是固有免疫反應(yīng)中用于識(shí)別各種內(nèi)源性或外源性抗原的一組受體。經(jīng)A53T突變型刺激24 h后，2和20μg/ml A53T突變型組與對(duì)照組的TLRs 1～4 mRNA表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.490﹑7.617﹑7.328和4.031，P=0.027﹑0.005﹑0.009和 0.048）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，2和20μg/ml A53T突變型組TLRs 1～4 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，其中以TLR1 mRNA和TLR2 mRNA增長幅度較大（見圖2）。Western blot檢測結(jié)果顯示，當(dāng)A53T突變型濃度增加到20μg/ml，TLR2蛋白的表達(dá)水平升高（見圖3）。結(jié)果提示，α-syn誘導(dǎo)和激活星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)。另外，野生型α-syn對(duì)TLRs也產(chǎn)生較弱的免疫誘導(dǎo)效應(yīng)。

2.3 α-Syn誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)

NF-κB作為非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，是多種炎癥因子基因表達(dá)的上游調(diào)節(jié)分子，在固有免疫炎癥通路中發(fā)揮中樞和核心的調(diào)控作用。分別經(jīng)野生型α-syn﹑A53T突變型處理后，2和20μg/ml A53T突變型組與對(duì)照組的NF-κB mRNA表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.640和9.810，P=0.047和0.008）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，2和20μg/ml A53T突變型組NF-κB mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組。其中，經(jīng)野生型α-syn處理后，20μg/ml A53T突變型組較2μg/ml A53T突變型組NF-κB mRNA表達(dá)水平升高幅度較大（P＜0.05）（見圖4）。Western blot檢測結(jié)果顯示，當(dāng)A53T突變型濃度增加到20μg/ml，NF-κB蛋白的表達(dá)水平升高（見圖5）。結(jié)果提示α-syn能提高NF-κB表達(dá)的水平，增加固有免疫反應(yīng)程度，并且A53T突變型具有較強(qiáng)的刺激活性。

圖2 A53T突變型對(duì)TLRs 1～4表達(dá)的激活作用 （±s）

圖3 TLR2蛋白的表達(dá)

圖4 野生型α-syn及A53T突變型對(duì)NF-κB表達(dá)的激活作用 （±s）

圖5 NF-κB蛋白的表達(dá)

3 討論

大量研究證明，在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中，星形膠質(zhì)細(xì)胞扮演重要角色，其激活固有免疫和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元毒性微環(huán)境的形成[2-3，5]。近年來，在α-syn介導(dǎo)的神經(jīng)元變性的炎癥病理中，研究的重點(diǎn)都放在α-syn對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的致炎效應(yīng)上[7，9]，包括TLRs表達(dá)和促炎癥細(xì)胞因子分泌等，然而其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫誘導(dǎo)作用卻很少得到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，α-syn及其A53T突變型上調(diào)TLRs 1～4和NF-κB的表達(dá)水平，且A53T突變型具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)效應(yīng)，揭示α-syn能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，激活腦的固有免疫反應(yīng)。

關(guān)于α-syn對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活效應(yīng)，僅有幾篇文獻(xiàn)報(bào)道，例如將神經(jīng)元分泌的α-syn直接作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，刺激IL-6﹑IL-1β﹑ICAM-1 的釋放和 CXCL10 的表達(dá)[8，10-11]。TLRs作為免疫原識(shí)別受體也參與神經(jīng)變性的炎癥病理變化，并且與α-syn誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，例如在小膠質(zhì)細(xì)胞，α-syn上調(diào)TLR2﹑TLR3和TLR7的表達(dá)，并且激活炎癥反應(yīng)[7，12]，而對(duì)NF-κB和TNF-α沒有作用[12]。然而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，α-syn誘導(dǎo)的TLRs激活罕有報(bào)道，目前仍不清楚。本研究結(jié)果彌補(bǔ)這一事實(shí)，證實(shí)TLRs 1～4都得到激活。NF-κB作為神經(jīng)炎癥通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，直接參與神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性病理變化，這已在小膠質(zhì)細(xì)胞得到證實(shí)[13]，同時(shí)α-syn也上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的表達(dá)[14]。本研究證實(shí)，α-syn提高星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB表達(dá)，與其對(duì)TLRs的誘導(dǎo)效應(yīng)是一致的，進(jìn)一步提示α-syn通過刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，激活腦的固有免疫反應(yīng)，為神經(jīng)退行性疾病的致病機(jī)制的研究提供了有力的免疫學(xué)證據(jù)。

綜上所述，α-syn作為神經(jīng)細(xì)胞的異常代謝產(chǎn)物，是一種較強(qiáng)的免疫原物質(zhì)，增加星形膠質(zhì)細(xì)胞的TLRs活性，提高NF-κB的表達(dá)，直接參與對(duì)腦固有免疫的激活，并且A53T突變型具有較強(qiáng)的免疫誘導(dǎo)效應(yīng)，為α-syn參與星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制研究提供了有力的免疫學(xué)證據(jù)。

致謝 感謝美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Sean Leng教授實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)條件。

參 考 文 獻(xiàn)：

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