孫志敏，張錚，文童，張麗娟，楊超，柳彥君，胡桃紅

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)火箭軍總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 錦州 121000；2.中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，北京 100088；3.中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院輸血科，北京 100088）

近年來研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs）具有自我更新和多向分化的潛能，也具有組織修復(fù)和抑制自身免疫的潛在可能性，是自身干細(xì)胞治療理想的種子細(xì)胞[1-2]。而老年患者自身的BM-MSCs也處于衰老狀態(tài)下，移植入組織后活力及增殖能力下降，嚴(yán)重限制了臨床療效。因此，明確BM-MSCs衰老損傷的機(jī)制，是提高自體干細(xì)胞療效的關(guān)鍵問題。衰老是生物體內(nèi)損傷的分子﹑細(xì)胞﹑組織不斷積聚，導(dǎo)致生物體功能減退和細(xì)胞正常生理功能改變的過程[3]。前期研究證實(shí)，自噬通過清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)等，來維持細(xì)胞功能，并參與細(xì)胞衰老過程[4]。本實(shí)驗(yàn)探討衰老細(xì)胞中自噬水平的變化及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

C57/6健康小鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），胎牛血清﹑α-DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，淋巴細(xì)胞分離液（上?；瘜W(xué)試劑二廠），胰蛋白酶﹑LC3抗體購自美國Sigma公司，鼠抗p62﹑Beclin-1抗體﹑β-actin抗體購自英國Abcam公司，p-Akt抗體（美國CST公司），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothe growth factor, VEGF）ELISA試劑盒﹑堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）ELISA試劑盒﹑胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor, IGF-1）ELISA試劑盒﹑肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）ELISA試劑盒購自美國R&D公司，GFP-LC3質(zhì)粒（美國Invivogen公司），X-treme GENEHP DNA轉(zhuǎn)染試劑﹑脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal deoxynucleotidly transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司，Akt活性檢測試劑盒（美國Bio Vision公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO-TEK公司），BX50型顯微鏡（日本Olympus公司），Nikon A1 激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BM-MSCs的分離和培養(yǎng) 年輕小鼠（8周齡）和老年小鼠（18個(gè)月齡）麻醉脫頸椎處死后，在無菌狀態(tài)下分離其股骨和脛骨。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）沖出骨髓，比重1.077的淋巴細(xì)胞分離液作梯度離心（2 000 r/min離心30min），收集單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌，將含10%胎牛血清的α-DMEM培養(yǎng)基放入培養(yǎng)皿，在5%二氧化碳CO2﹑37℃孵箱中培養(yǎng)。換液1次/3 d。待細(xì)胞融合接近80%，用0.25%胰蛋白酶（0.1 ml/cm2）消化2～3min，將細(xì)胞以1×104個(gè)/ml傳代。采用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀 取第3代小鼠BM-MSCs，胰酶消化3min，離心后PBS洗滌重懸2次，細(xì)胞以1.5×106個(gè)/ml接種于4個(gè)1.5 ml EP管中，分別加入抗小鼠CD31﹑CD45﹑CD90﹑CD29，置于4℃冰箱，避光孵育30min，PBS洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測﹑分析。

1.2.3 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測 在預(yù)置玻片的24孔板上按3×104個(gè)/ml培養(yǎng)兩組BM-MSCs，PBS清洗。按分組情況，用含10%胎牛血清的α-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加終端轉(zhuǎn)移酶和熒光素標(biāo)記的dUTP，37℃孵育45min。PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入DAPI染色識(shí)別細(xì)胞核，PBS洗滌細(xì)胞3次后，用Nikon A1激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果。TUNEL標(biāo)記陽性（綠色熒光）的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的百分比作為凋亡指數(shù)。所有操作在暗室中完成。

1.2.4 ELISA 培養(yǎng)兩組 BM-MSCs 6×106個(gè) /ml，PBS清洗。按分組情況，用含10%胎牛血清的α-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，提取細(xì)胞上清液，0.22μm濾器抽濾，按照VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HGF蛋白ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 Western blot檢測 按分組情況，培養(yǎng)BMMSCs 5×106個(gè)/ml。4℃條件下冰上裂解細(xì)胞5min。裂解液包含TBS﹑Triton-X100破膜（1 mm，美國Sigma公司）﹑4%丙三醇﹑二乙胺四乙酸（1 mm，美國Sigma公司）和蛋白酶抑制劑PMSF（1 mm，美國Roche Molecular Biochemicals公司），12 000 r/min離心10min后提取蛋白液。兩組分別取50μg蛋白樣品，12% SDS-PAGE凝膠電泳90min﹑120 V，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜300 mA﹑40min，蛋白膜在封閉液中封閉60min。分別添加兔抗鼠LC-3抗體（1∶500）﹑Akt抗體（1∶500），p-Akt抗體（1∶500）﹑β-actin抗體（1∶2000）抗體，4℃孵育過夜。PBS洗膜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200），室溫孵育90min，洗膜，采用ECL試劑按步驟檢測蛋白表達(dá)，Image-Pro Plus 6.0.1軟件分析各條帶吸光度值作定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BM-MSCs表型比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，年輕組和老年組BMMSCs均為CD31﹑CD45陰性，而CD90和CD29表達(dá)陽性，提示兩組BM-MSCs細(xì)胞表型無明顯差異。見圖 1﹑2。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較

年輕組和老年組BM-MSCs經(jīng)TUNEL和DAPI染色的免疫熒光檢測圖見圖3。年輕組BM-MSCs細(xì)胞凋 亡率為（12.583±1.212）%，老 年組為（37.831±3.432）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.128，P=0.000），老年組BM-MSCs細(xì)胞凋亡率高于年輕組（見圖4）。

2.3 BM-MSCs分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF水平

年 輕 組 BM-MSCs分 泌 VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HGF 分 別 為（424.545±88.735）﹑（14.587±4.413）﹑（36.334±2.952）和（15.335±5.915）pg/ml，老年組BM-MSCs分泌 VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HGF分別為（335.737±65.574）﹑（8.132±2.248）﹑（28.764±4.252）和（9.723±1.835）pg/ml，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.673﹑4.423﹑3.273和2.867，P=0.014﹑0.000﹑0.014和0.010），老年組分泌蛋白水平均低于年輕組。見圖5。

2.4 BM-MSCs自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62的表達(dá)

年輕組小鼠BM-MSCs的LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ﹑Bclin 1﹑ATG12-5﹑p62蛋 白 相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別為（0.68±0.13）﹑（1.16±0.12）﹑（1.12±0.12） 和（1.01±0.11），老年組小鼠 BM-MSCs的 LC3-Ⅰ /LC3-Ⅱ﹑Bclin 1﹑ATG12-5﹑p62蛋白相對(duì)表達(dá)量分別 為（0.32±0.02）﹑（0.41±0.09）﹑（0.30±0.04） 和（2.67±0.31），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.985﹑9.315﹑11.38 和 8.794，P=0.007﹑0.007﹑0.003 和 0.001），老年組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ﹑Bclin1﹑ATG12-5表達(dá)水平低于年輕組，p62表達(dá)水平高于年輕組。見圖6﹑7。

圖1 第3周兩組小鼠BM-MSCs細(xì)胞形態(tài) （光鏡）

圖2 兩組小鼠BM-MSCs細(xì)胞表型

圖3 BM-MSCs自噬相關(guān)免疫熒光

2.5 BM-MSCs自噬調(diào)節(jié)通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果表明，年輕組與老年組BM-MSCs中Akt和mTOR無差異，而老年組p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平高于年輕組（見圖8）。年輕組和老年組的p-Akt/Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量分別（0.25±0.05）和（0.51±0.09），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.647，P=0.000），老年組高于年輕組。年輕組和老年組的p-mTOR/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別（0.14±0.02）和（0.27±0.03），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.062，P=0.000），老年組高于年輕組（見圖9）。

圖4 兩組小鼠BM-MSCs細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

圖5 兩組小鼠BM-MSCs分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF水平比較 （±s）

圖6 BM-MSCs自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖7 兩組小鼠BM-MSCs自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

圖8 BM-MSCs自噬調(diào)節(jié)通路蛋白的表達(dá)

圖9 兩組小鼠自噬調(diào)節(jié)通路蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

3 討論

缺血性心臟病是臨床上死亡率較高的一種疾病[5]。自體干細(xì)胞移植是一種新的治療缺血性心臟病的方法[6]，但是干細(xì)胞移植入組織后活力及增殖能力下降是治療中遇到的最主要問題。BM-MSCs具有較強(qiáng)的多向分化和自我更新潛能[7]，可以通過旁分泌作用改善梗死的心肌組織[8]，是治療缺血性心臟病的一種理想種子干細(xì)胞。缺血性心臟病多見于老年患者，用于自體移植治療的BM-MSCs同樣處于衰老狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)前期研究證實(shí)，衰老的BM-MSCs移植入心肌組織后，活力及增殖能力明顯下降，療效不理想[9]。因此，探究BM-MSCs衰老過程中活力及增殖能力下降的機(jī)制，是提高其療效的關(guān)鍵。

自噬是一種高度保守的生理過程，廣泛存在于大部分真核細(xì)胞中[10]。自噬在細(xì)胞中具有雙刃劍的作用[11]。在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞自噬水平較低，通過清除細(xì)胞內(nèi)功能受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)來維持細(xì)胞的正常生理功能。但是在應(yīng)激條件下，如細(xì)胞能量缺失﹑缺血等，細(xì)胞自噬水平明顯增高，過度降解細(xì)胞自身成分，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[12]。在細(xì)胞衰老的過程中，自噬也發(fā)揮一定作用。自噬的過程復(fù)雜，可分為啟動(dòng)﹑形成和降解再利用3部分。啟動(dòng)階段是由mTOR相關(guān)靶點(diǎn)誘導(dǎo)，在自噬相關(guān)基因（ATG）蛋白的協(xié)同下，形成弧形凹陷的雙層膜結(jié)構(gòu)，即自噬前體。然后自噬前體識(shí)別并包裹細(xì)胞內(nèi)功能受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，雙層膜結(jié)構(gòu)逐漸延伸直至融合，形成完全包裹細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的自噬體。自噬體形成后，與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，自噬體內(nèi)層膜及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)最終被降解，降解產(chǎn)物進(jìn)入胞漿進(jìn)行再利用[13-15]。LC-3和Beclin 1是自噬發(fā)生和形成過程中重要的自噬相關(guān)分子，Beclin 1能夠聚集自噬體，并且在自噬的過程中起正調(diào)控作用[16]。在動(dòng)物細(xì)胞自噬的過程中，p62是一種普遍表達(dá)的蛋白質(zhì)，可與前自噬體膜LC-3相互作用，并在Atg12-5的參與下形成自噬體，自噬體在溶酶體的作用下降解，因此p62的水平與自噬呈負(fù)相關(guān)[17-19]。本研究中利用Western blot檢測自噬相關(guān)的蛋白，結(jié)果提示衰老BM-MSCs中LC3-Ⅰ﹑LC3-Ⅱ﹑Beclin 1﹑ATG12-5表達(dá)減少，而p62表達(dá)增多。提示衰老BM-MSCs自噬水平下調(diào)，與前期研究結(jié)果一致。

衰老是生物體內(nèi)受損和有缺陷的細(xì)胞不斷進(jìn)行積累，造成生物體功能的衰退和器官老化的過程[5]。本實(shí)驗(yàn)TUNEL結(jié)果提示，老年組細(xì)胞凋亡較年輕組增加，提示衰老可以增加BM-MSCs的細(xì)胞凋亡。前期研究結(jié)果表明，在整個(gè)衰老過程中，自噬相關(guān)蛋白及自噬活性均有所下降，提示自噬的水平可能與衰老損傷有關(guān)。BM-MSCs可以分泌多種細(xì)胞因子，如VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HGF[20]，但是衰老對(duì)BMMSCs旁分泌作用的影響及機(jī)制仍不是很明確。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA檢測BM-MSCs分泌細(xì)胞因子的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年組BM-MSCs中VEGF﹑bFGF﹑IGF-1﹑HFG的分泌量較年輕組下降，提示衰老BM-MSCs旁分泌功能受損。上述結(jié)果說明，在衰老過程中，BMMSCs凋亡增加，自噬水平及旁分泌功能下降。

許多研究指出，自噬過程調(diào)節(jié)的一條重要途徑是Akt-mTOR途徑[21]。其中Akt又稱為蛋白激酶B，是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。mTOR是一類大分子蛋白，也是調(diào)控細(xì)胞生長﹑增殖及自噬的重要信號(hào)通路。mTOR有mTORC1和mTORC2 2種復(fù)合物形式，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖﹑凋亡及自噬等的主要是mTORC1。在細(xì)胞因子的作用下，Akt活化后將信號(hào)下傳至mTOR，活化后的mTOR激活其下游的相關(guān)因子，促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成﹑增殖及生長，加速細(xì)胞代謝，抑制細(xì)胞的自噬作用[14-15]。在本實(shí)驗(yàn)中衰老組BMMSCs中p-Akt﹑Akt﹑p-mTOR﹑mTOR表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡增加。

通過實(shí)驗(yàn)筆者對(duì)自噬和衰老的分子機(jī)制及相互作用有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，老年組BMMSCs細(xì)胞凋亡增加，分泌蛋白功能減弱，自噬及自噬相關(guān)蛋白水平下降，p-Akt﹑Akt﹑p-mTOR﹑mTOR蛋白表達(dá)增加。衰老是細(xì)胞自噬增加的一個(gè)影響因素，自噬增加又能夠引起衰老。

參 考 文 獻(xiàn)：

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